Deze samenvatting omvat alle noodzakelijke informatie op een gestructureerde manier van de powerpoint van hoofdstuk4, eiwitten. Heeft verduidelijking waar nodig.
2.4.1: ISOLEREN VAN EIWITTEN Serine of threonine fosfatasen Natrium fluoride
Natrium pyrofosfaat
- starmateriaal homogeniseren → ruw eiwitlysaat
Tyrosine fosfatasen Natrium orthovanadaat
- samenstelling homogenisatiebuffer voor eiwit:
▪ Buffer: pH ▪ Mengsel van meerdere protease-inhibitoren in buffer
▪ Zout: niet denatureert & oplost ▪ Bekomen van ruw eiwitlysaat → verder opzuiveren via:
▪ Protease inhibitoren: niet afbreekt o chromatografie
▪ Fosfatase inhibitoren: fosforylaties geconserveerd blijven o Elektroforese
▪ Detergent: oplossen celmembraanReducerend agens: breken
disulfidebruggen
2.4.2: AANMAAK VAN EIWITTEN
a) protease inhibitoren:
- doel:
Protease familie Protease inhibitoren
Serineproteasen PMSF 1) Wetenschappelijk onderzoek
→ Als serine essentieel is voor katalytische activiteit Benzamidine 2) Farmaceutische industrie
aprotinine 3) Waspoederindustrie
Metalloproteasen EDTA ( binden aan 4) Voedingsindustrie
→metaalionen nodig voor katalytische activiteit metaalionen)
CHEMISCHE SYNTHESE IN VITRO
Cysteïne proteasen Leupeptine
→cysteïne essentieel voor katalytische activiteit - Voordelen:
Aspartaat proteasen Pepstatine ▪ Synthese artificiële eiwitten
→aspartaat essentieel voor katalytische activiteit ▪ Geen problemen toxiciteit organismen
- Nadelen:
▪ Mengsel van meerdere protease-inhibitoren in buffer ▪ duur
▪ Met of zonder EDTA ▪ Kleine #
▪ Per cyclus:
b) fosfatase inhibitoren: o Opbrengst verlagen extra AZ
Fosfatasefamilie Fosfatase inhibitoren o Enkel korte sequenties
o Toepassingen:
, 2
▪ Aanmaak peptiden voor antistoffen ▪ vaak koppelen aan in vitro transcriptie, translatie
▪ Aanmaak artificiële eiwitten ▪ toepassingen:
o karakteriseren van ORF
Synthese van eiwitten door koppelen van peptiden:
o structurele & functionele studies
* einde van peptide linker:
- reactieve groep
IN VIVO EXPRESSIE SYSTEMEN
- reageert enkel met carboxygroep van AZ
▪ expressie van recombinant eiwit komt:
* beschermingsgroepen reacties voorkomen: o na introductie recombinant DNA
= recombinante eiwitproductie
- groen ~ N terminus bescherming
▪ Gekozen organisme:
- rood ~ bescherming zijketens o Bepaalt keuze expressie van plasmide & sequentie
* vrijzittende aminogroep reactie carboxygroep 2e AZ
Codon optimisatie:
* alle AZ ingebouwd:
o Wat:
- klievingsreactie: eiwit losmaken van peptide linker
▪ aanpassen eiwitcoderende DNA sequentie
o waarom:
▪ hogere eiwitexpressie
ENZYMATISCHE SYNTHESE IN VITRO
o waar:
▪ gebruik van reticulocyt ▪ codons waarvoor veel tRNA’s aanwezig zijn
o immature RBC o voorbeeld arganine als codon:
o bevat ribosomen ▪ 22%: AGA human sequentie
o bevat AZ en E ▪ 1 %: AGA E. Coli
o heeft sterk eiwittranslatiemechanisme → E. coli weinig tRNA
o gespecialiseerde aanmaak → moeilijk uit arginine een eiwit bouwen
→ codon optimalisatie nodig
, 3
Transiënte eiwitproductie Stabiele eiwitproductie ▪ PTM:
Transfectie van DNA Transductie van DNA o Bepaald structuur & functionaliteit
= DNA integreert NIET in genoom gastheercel = DNA integreert WEL in genoom ▪ Aggregaten/ inclusion bodies:
Gastcel delen → recombinant verdund Subcultuur aanwezig = slecht gestructureerde eiwitten
Duur: enkele dagen Duur: maanden o Voordelen:
▪ Geen last toxiciteit voor bacterie
▪ Beschermd van proteolyse
▪ Zuiver & hoog geconcentreerd eiwit
IPTG inductie
▪ Laboratoriumschaal vs. Industriële schaal Lac repressor binden op T7.
Kleine volumes grotere volumes ( tanken)
Hierdoor geen transcriptie of
translatie.
Expressiesystemen IPTG bindt Lac repressor & neem
af T7. Hierdoor kan T7 RNA
1) Bacteriële expressiesystemen polymerase binden & translatie
▪ E. Coli: plaatsvinden
o vaak gebruikt
o Bacterie: kapot voor eiwitsecretatie
▪ Bacillus subtilis: Artificiële bacteriële ribosomen ( Ribo-T)
o Eiwitsecretie in medium
o Bacterie: niet kapot voor eiwitsecretatie ▪ Witte ribosoom:
o mRNA transleren voor eiwitaanmaak
▪ Gekleurde ribosoom:
o extra artificiële ribosoom
o Ribo-T: zet kleine & grote SE aan elkaar
o andere Shine-Dalgarno sequentie herkennen:
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur charlotteallaert1. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €4,49. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
