Methoden hoofdstuk 1: Inleiding en situering
Algemene info (+ vb vragen)
Methoden hoofdstuk 2: Biomedische vraagstelling en onderzoeksmethodiek
2.1 Het domein van BMW onderzoek is zeer breed
Disciplines: fysiologie vs pathologie
Niveaus: organisme – weefsel – cel – subcellulair
2.2 Breed gamma aan vraagstellingen
Open exploratief: geen hypothese, veel methoden gebruiken
Hypothese-gedreven: vooropgesteld antwoord, specifieke methodes
Fundamenteel: hoe iets in mekaar zit, geen concrete toepassing / translationeel: overgang
fundament en klinisch, doelgerichter, toepassing nodig / klinisch: patiënt-gericht, PICO
principe, 4 fasen vrijwilligers, patiënten, grotere groep, hele grote groep effect, dosis
optim + eff, werking, neveneff, EU EMA goedkeuring
Analyse in vivo: levend organisme bepaling / ex vivo: metingen op staal organisme / in vitro:
metingen in proefbuis / in silico: analyseren met computer
2.3 Ontwerp van biomedische experimenten
Probleem literatuur hypothese bio/modelsyst bepaling variabele keuze
methode uitvoering experiment herhaling exp analyse resultaten formulering
conclusie
2.4 Twee grote klassen van methoden
Methoden voor analyse: iets meten
Methoden voor modulatie: iets veranderen aan organisme/proefdiermodel
2.5 Statische bepalingen vs kwantitatieve, dynamische en vergelijkende analyse
Statisch: iets relatief onveranderd bepalen, discrete waarden
Kwantitatief, dynamisch, vergelijkend: iets dat makkelijk varieert bepalen, range v waarden
2.6 Selectie van de methode
Cfr criteria
2.7 Vereisten/eigenschappen van methoden
Precisie = variabiliteit = maat voor reproduceerbaarheid
, Accuraatheid: verschil tssn gemeten en “echte” waarden
Detectielimiet = gevoeligheid = kleinste waarde die met bepaalde gekozen zekerheid
gemeten kn w
Analytische range / dynamic range = gebied dat reproduceerbare gegevens geeft
Analytische specificiteit = selectiviteit = mate waardoor andere componenten in het systeem
interfereren
Analytische sensiviteit = maat v verandering in output tov verandering in input
Robuustheid = mate waarin methode consistent resultaat geeft ondanks kleine versch in
experimentele parameters
2.8 Experimentele variatie
Systematische fout (= reproduceerbare fout) vs random fout (onvoorspelbare fout)
Methoden hoofdstuk 3: Studiemateriaal
3.1 Humaan organisme
Organisme – vloeistoffen – weefselbiopten
Voordelen: direct relevant
Nadelen: beperkte mogelijkheden (ethische commissie) – informed consent
3.2 Modelsystemen
3.2.1 Xenograften
Bv transplantatie humaan weefsel in muis (PDX), kankercellijn (subcutaan, orthotopisch)
Voor- en nadelen: in vivo testen wat nt op mens, artificieel: verschil muis-mens en
uitgeschakeld imm syst, duur
3.2.2 Weefselculturen
Voorbeeld: explant huidtumor
Voor- en nadelen: manipuleerbaar, cel-cel interactie, beperkt houdbaar, dedifferentiatie
3.2.3 Celculturen
Primaire culturen (rechtsreeks v weefsel bereid)
o Werkwijze: stukjes hechten plastiek uitgroeien op versch manieren, mechan diss,
enzym diss, EDTA (cellen losser v elkaar)
o Voor- en nadelen: vele celtypes, zuiver of co (cel-cel), eig deels bewaard, makkelijk
manipuleren, slechts enkele passages (telomeren), moeilijk zuivere culturen
, Geïmmortaliseerde cellijnen
o Werkwijze: primaire culturen transfecteren/transduceren of infecteren
immortalisatie doorkweken + stock invriezen (serum + DMSO)
Kankercellijnen
o Werkwijze: cellen v tumor (al immortalis), beschikbaar in banken (aanvragen)
o Voor- en nadelen: goedkoop, kweekbaar, manipuleerbaar, afwijkend, eig veranderen
(lagere passage starten), heterogeen karyotype
Stamcellen
o Multicellulaire organismen, zelfhernieuwing, differentiëren
o Adult: herstelsysteem voor lichaam, multipotent (beenmerg, bloed, weefsel)
o ESC: morula (totipotent), IMC v blastocyst (pluripotent)
Nadelen: ethisch, pre-differentiatie noodz teratoma’s (kanker), vreemd
voor imm syst
o iPSC (geïnduceerde pluripotente stamcellen): gediff adulte cellen dedifferent mbv
eiw belangr voor ESC pluripotentie (4 sleutelgenen)
Voor- en nadelen: patiënt-specifiek, lange expansie, (theoretisch) alle
celtypes maken in vitro, karyotype checken, goeie controle nodig,
variabiliteit, weinig robuust, dure media
Toepassing: transplantatie genetisch matching gezonde cellen of ziekte
specifieke behandeling
Organoïden
3.2.4 Werken met celculturen
Recipiënten: platen en flessen, statisch & dynamisch
Celcultuur media:
o Basale media: glucose, Na-pyruvaat, essent az, zouten, vitamines
o Foetaal kalf serum: vit, sporenelem, lipiden, vz, mineralen, carbohydr,
decomplementatie, nadelen: batch variatie, groei-inhib fact, nt gedefin, mog
contamin, ethische bezwaren, serum vervangingen
o Alternatieve energiebronnen: L-glutamine, pyruvaat
o pH buffer: CO2/Na-bicarbon, fosfaat, HEPES, pH-indic: fenolrood
o Antibiotica
, o Medium sterilisatie: filtratie over membr, bewaren donker
Celcultuuromgeving: celcultuurlokaal met beperkte toegang
o Bioveiligheidsklassen: I, II, III, IV
Cellen oogsten, tellen, passeren
o Terminologie: doubling time, passage, split ratio
o Oogsten: enzymatisch, trituratie
o Tellen: celsuspensie met Trp blauw (blauw = dood)
Manueel: mbv Burker telkamer
Geautomatiseerd: via foto (snel, precies, duur) of via Coulter counting
cellen (mengen elektroliet) in vloeist stroom door porie, elektr geleiding
verandert (daling stroom) afh v grootte cel, dat meten
Cryopreservatie: medium (DMSO, FBS vriespunt verlagen, beter dehydrateren), rate-
controlled cooling in isopropanol, daarna vloeibare stikstof, ontdooien: snel (DMSO toxisch),
dilutie groeimedium, centrifugatie, resuspensie
Sterilisatie en desinfectie:
o Steriliseren = doden alle (micro)organismen mbv autoclaaf, droge hitte, gas, straling,
filtratie
o Desinfecteren = verhinderen overdracht (micro)organismen mbv vernveling
ethanol/isopropanol, straling (UV licht)
Contaminatie:
o Bronnen: operator, omgeving, LAF, …
o Types: bacterieel, gist, schimmel, virus, …
o Detectie: macroscopisch zichtbaar (verkleuring, troebel), microscopisch, mycoplasma
(regelmatig testen, PCR of colorimetrisch)
Algemene voor-en nadelen: goede controle, goedkoper, miniaturisatie, manipuleerbaar,
serum of slecht gedefinieerde bestanddelen nodig, steriliteit nodig, instabiel, artificieel
(anders dan in vivo), uitputting media, cellijn misidentificatie (authentificatie mbv
karyotypering, PCR STR)
3.2.5 Modelorganismen
Voor- en nadelen: eenvoudig, manipuleerbaar, meetbaar, kweekbaar, goedkoop
Gist
