Volledige samenvatting celcultuur, ELISA en flowcytometrie.
De samenvatting is gemaakt adhv:
- Powerpoints
- Eigen nota’s uit de les
- Cursus flowcytometrie
- Handboek celcultuur
- Verschil continue en normale cellijnen
- Cellijn met bijhorende cultuuromstandigheden voorstellen voor een biomedische toepassing
- Detectiemethoden die gebruik maken van antilichamen onderschijden
- Analyse- en sorteringsprincipe van een multilaser flowcytometer
- Toepassingen van flowcytometrie in de diagnostiek en in biomedisch onderzoek
- Microbiologisch veiligheidscabinet correct gebruiken
- Aseptisch werken met celculturen
- Primaire cultuur aanmaken
- Celculturen ontdooien, onderhouden en invriezen
- Enzym immuno essay opstellen
- Celcylusanalyse en DNA-inhoud van cellen analyseren op een flowcytometer
- Fluorescentie-overspraak compensatie uitvoeren op een flowcytometer
Celcultuur
Hoofdstuk 1: Inleiding
Geschiedenis:
- 1907 (Ross Harisson):
o Hij isoleerde weefsel uit kikkers (koudbloedig) en probeerde dit weefsel levend te houden. Hij
kon deze op kamertemperatuur levend houden.
o Maar hoe hou je dit steriel?
- Doorbraak rond 1950:
o Antibiotica: pensiline
o Trypsine = protease
o Chemisch gedefinieerde cultuurmedia
→ Bij het weefsel wordt het enzym trypsine bijgedaan om losse cellen te verkrijgen. Zo
kunnen de cellen gelweekt worden. Er worden antibiotica bijgedaan om het steriel te
houden. Om de cellen te kweken zijn er ook voedingsstoffen nodig. Er wordt dus een
cultuurmedium aangemaakt = water + extra stoffen (suikers, vetzuren, vitamines…) De
incubator wordt ingesteld op 37 °C bij het kweken van cellen.
- Exponentiële toename na 1970:
o Er verschijnen alsmaar meer publicaties in wetenschappelijke tijdschriften
- Polio virus (= kinderverlamming)
o Virussen variëren in grootte tss 30 en 300 nm. Het polio virus is 30 nm.
o Virussen zijn obligaat intracellulair: Ze kunnen enkel in cellen groeien
o Naaktvirus: heeft spikes → Nodig om te binden met de receptoren van een cel. Het
virusdeeltje kan zo naar binnen en zich vermenigvuldigen.
o Je hebt ook virussen met een envelop
o 1949 (Enders): Kweek in menselijke embryonale cellen (virus gekweekt in celculturen)
1
, o 1953 (Salk): Formaline geïnactiveerd polio vaccin
▪ Alle poliovirussen worden gecollecteerd en inactief gemaakt zodat ze niet verder
kunnen groeien. Dit gebeurt adhv formaldehyde door een alkylatie reactie waarbij
een alkylgroep hangt aan een aminozuur. Dit zorgt ervoor dat het eiwit niet meer
functioneert. Formaldehyden/ formalinen maken het organisme dus dood, maar
behouden de structuur. Formaldehyden worden ook gebruikt bij preparaat
behouding)
o 1957 (Sabin): Levend verzwakt polio vaccin
▪ De virussen hierbij kunnen nog groeien, maar ze zijn verzwakt. Dit wordt bekomen
door ervoor te zorgen dat het virus alleen maar kan groeien in celculturen en niet bij
de mens.
▪ Hoe? De cellen worden in het labo gekweekt. Daarna wordt het virus toegevoegd.
De cellen groeien en gaan kapot. De virus bevindt zich dan in het medium waarvan
de pH 7.2 is en een rode kleur heeft. De virussen worden gecollecteerd en opnieuw
in een groeifles met cellen en virusdeeltjes terug toegevoegd.
- HELA cells
o Henriette Lacks overleden
▪ Had baarmoederhalskanker → cellen gecollecteerd en je kon ze kopen
o Veelvuldig gebruikt bij kankeronderzoek
- Hybridoma-technologie:
o 1975: Köhler en Milstein
o Productie van monoklonale antilichamen = antilichamen tegen 1 gen
o Antilichamen worden door B cellen gemaakt, maar deze hebben een eindige duur
→ Oplossing:
▪ Een muis dat gen-inactiveerd is krijgt een antigen ingespoten
▪ B cellen makken antilichamen aan
▪ Sommige B cellen gaan echter andere antilichamen maken die niet passen op het
antigen
▪ Aan een tumorcel (= continue cel) voegt men polyethyleen glycol toe en men
fusioneert hiermee de B cellen
▪ Op deze manier ontstaan er hybridomas = B cellen die eeuwig groeien
2
, ▪ De hybridomas worden vervolgens gescreend. In een plaat met antigenen brengt
men de plasmacellen in. De foute antilichamen laat men wegwassen. De goede
hybridomas (met correcte antilichamen) worden in cultuur gebracht.
- Cel- en weefseltechnologie:
o Implantaten
o Skingrafting: brandwonden, diabetesvoet
▪ Cellen + polymeer: cellen hechten aan op fibroblasten waardoor een cellaagje wordt
aangemaakt voor wondherstel en beschermt tegen micro-organismen
o Diabetes type I: produceren niet genoeg insuline
Zuurstof en voedingsstoffen worden
binnengelaten → de eilandjes van
Langerhans worden metabool actief
en produceren insuline
Voordelen
- Controle van de omgeving:
o Fysiochemische parameters: pH (7,2), temperatuur (37 °C), osmotische druk (0,9 %), zuurstof
(21 %) en koolstofdioxide (0,03 %)
o Fysiologische parameters: voedingsstoffen (+ % serum)
- Karakterisatie en homogeniteit:
o Redelijk homogeen (na een tijd snelst groeiende cellen over)
3
, o Na een aantal passages groeien de cellen minder goed en sterven af. Er wordt dan een
cryostok gemaakt.
- Kostprijs:
o Miniaturisatie: kleine hoeveelheden monster en reagentia
o Proefdierexperimenten zijn duur
- Ethiek
Schema :
Beperkingen
- Expertise:
o Aseptisch werken (zonder celcultuur te besmetten)
o Tragere groei dan meeste bacteriën en schimmels → pH verlaagt bij besmetting want de
bacteriën gebruiken de glucose. Er worden daarom antibiotica toegevoegd aan het medium.
- Hoeveelheid:
o Laboschaal: maximum 10^9 cellen → gram cellen
o Industriële schaal vereist opschaling
- Instabiliteit:
o Normale cellen hebben een beperkte levensduur (senescentie)
→ Oplossing: Cryostok (EX: leg uit adhv schema)
- Cultuuromgeving vs in vivo:
o 2D (in vivo: 3D)
▪ Cel-cel en cel-matrix interacties
▪ Cellen zijn beweeglijk
▪ Snelle celdeling want ze krijgen veel voedingsstoffen, in vivo is dit trager want je
hebt er ook andere weefsels, zoals bv het bindweefsel
▪ 1 of 2 celtypes blijven over, deze groeien het snelste
o Oversimplificatie van het cultuurmedium
4
, ▪ Zenuwstelsel en endocriene organen ontbreken
o Cellulair metabolisme is meer constant
▪ Energiemetabolisme: glycolyse, in vivo: citroenzuurcyclus
Hoofdstuk 2: Cel- en weefselkweekculturen: definities
Orgaanculturen
- Gemaakt van embroyonale organen/ weefselfragmenten
- 3D weefselstructuur en functie gedeeltelijk bewaard
- Rechtstreeks geïsoleerd uit organisme Tumor kan sneller
- Gekweekt op vloeistof-gasinterfase groeien en
- KU zelf niet delen, wel differentiatie optreden van cellen in orgaan verspreiden
- Weefsels goed karakteriseerbaar via histologie
- Stukje placenta met medium en
fibrine blijft in plaats.
- Kon nieuwe bloedvaten maken
- Verschillende stoffen toevoegen en
zien of groei al dan niet vermindert
Explant culturen
- Definitie:
o Rechtsreeks geïsoleerd uit organisme
o Vb.: huidbiopten, spierbiopten en tumorweefsels
- Werkwijze:
o Chirurgisch uitsnijden
▪ Grote hoeveelheid weefsel
▪ Perfusie (spoelen met zoutoplossing):
contaminatie met bloed verminderen
o Naaldbiopt
▪ Minder invasief
▪ Sneller
▪ Minder weefsel (< 1 g)
o Microdissectie met infrarood – of ultravioletlaser
▪ Precies een stukje weefsel uit biopt isoleren
o Na isolatie cellen onmiddellijk in steriele omgeving op celkweeksubstraat
▪ Ondergedompeld in cultuurmedium (voedingsstoffen)
- Voordelen:
o Cel-cel en cel-matrix interacties behouden
5
, ▪ Individuele celculturen: cel-matrix niet behouden
o Makkelijk manipuleerbaar
- Nadelen:
o Beperkt houdbaar
o Cellen kunnen de-differentiëren = verlies gespecialiseerde functie
→ Omdat ze in een andere omgeving komen + het zijn losse cellen, nt meer in vivo
Vb. spiercel gaat niet meer contraheren
Primaire culturen
- Definitie:
o Cellen rechtstreeks afkomstig van bepaald orgaan of weefsel
o Losgemaakt uit weefselstructuur en als individuele cellen verder in cultuur gebracht
o Heterogene mix van verschillende celtypes
- Voordelen:
o Co-cultuur → cel-cel interacties
▪ Ene celtype kan factoren uitscheiden die het andere celtype beïnvloeden
= paracrien effect
▪ Eigenschappen oorspronkelijk weefsel deels bewaard
▪ Wel mogelijk om bepaalde celtypes te isoleren uit heterogene mix
- Nadelen:
o Instabiel
▪ Onderlinge verhouding cellen wijzigt naarmate ze in langer in cultuur blijven
▪ Cellen kunnen de-differentiëren en verouderen (senesceren)
o Bepaald celtype groeivoordeel t.o.v. andere
Bv. fibrobmasten groeien redelijk snel
→ Samenstelling primaire cultuur verandert
o Primaire cellen: beperkte tijd in cultuur gehouden worden
Eindige celculturen
- Definitie:
o Primaire celcultuur die gesubcultiveerd wordt
o Beperkt aantal delingen na in kweek brengen (60-tal keer) = Hayflick limiet
▪ Verkorting van telomeren na elke celdeling
▪ Uitzondering: stamcellen dr verhoogde expressie van telomerase (enzym nodig voor
vorming telomeren)
Geïmmortaliseerde cellijnen
- Definitie:
o Cellen die oneindig lijken te delen
▪ In eindige cellijn kunnen mutaties optreden
→ Cellen verouderen niet meer en kunen eventueel onafhankelijk worden van
celadhesie
o Synoniem: continue cellijnen
o Groeien als monolaag op substraat
o Suspensie
→ Geen aanhechting meer nodig voor overleving en groei
- Ontstaan:
o Genetische veranderingen in vivo:
kankercellen
o Spontaan (mutaties)
o Geïnduceerd: transformatie
Organotypische celculturen
- Definitie:
o Gedeeltelijke reassociatie om 3D-structuur te creëren
▪ Primaire celculturen: verlies cel-cel en cel-matrix interacties
→ Creëren van een model vr deze cellulaire interacties
▪ Geen weefselcultuur
Cel- en weefselculturen
Propagatie = verderwerken
met zelfde fragment
7
, De evolutie van een cellijn
Geen transformatie
Totaal aantal
cellen
(logaritmisch)
Weken
Primaire Cellijn:
culturen - Homogeniteit
= 1 celtype, zelfde groeisnelheid en
totaal aantal cellen vermeerdert
Cryostok maken
Schema:
8
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur pati50. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €12,49. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
