Garantie de satisfaction à 100% Disponible immédiatement après paiement En ligne et en PDF Tu n'es attaché à rien
logo-home
Samenvatting Methoden In Het Biomedisch Onderzoek 2 H3 RNA (E0F94a) €3,99   Ajouter au panier

Resume

Samenvatting Methoden In Het Biomedisch Onderzoek 2 H3 RNA (E0F94a)

 73 vues  4 fois vendu

Samenvatting Methoden In Het Biomedisch Onderzoek 2 (E0F94a) In dit document staat alles wat je moet weten over H3 RNA. Het is een mix van de slides van de prof en college aantekeningen. Samenvatting is duidelijk en overzichtelijk geschreven.

Aperçu 4 sur 35  pages

  • 10 janvier 2023
  • 35
  • 2022/2023
  • Resume
Tous les documents sur ce sujet (14)
avatar-seller
SarahSilke
Hoofdstuk 3
RNA

DNA vs RNA

DNA RNA
- Ribose; is onstabiel en vatbaar voor afbraak
- Deoxyribose - Uracil
- Thymine - Enkelstrengig; secundaire en tertiaire structuur
- Dubbelstrengig in mogelijk omdat er onderlinge bindingen
dubbele helix kunnen ontstaan
- Langer - Korter
- 2’H - 2’OH; hierdoor is RNA vatbaarder voor afbraak
door RNAsen en daardoor is RNA dus korter



Soorten RNA

● mRNA = coderend messenger RNA, template voor eiwitten (1-4% van het totaalgewicht)

● rRNA = ribosomaal RNA voor verschillende subunits (80-95% van het totaalgewicht)

● tRNA = transfer RNA dat fysische link vormt tussen mRNA en eiwit

● short ncRNA (< 200 nucleotiden)
o miRNA = niet coderend, speelt rol in gezondheid en ziekte
o piRNA = piwi-interacting RNA (interageert met piwi proteïnen), belangrijk in
kiemcellen en dus vruchtbaarheid
o siRNA = short interfering RNA, belangrijk bij genexpressie
● long ncRNA (> 200 nucleotiden)

● Circulair RNA = recent ontdekt, functie nog onbepaald


Structuur mRNA

,Pre- mRNA is heel vluchtig en bevat nog de intronen.
Mature RNA= 5’ gemodificeerde groep, 5’UTR, protein-coding sequence, 3’UTR, poly-A staart


2.3.1 RNA verzorgen en bewaren

● Mogelijke problemen:

– RNA profiel verandert na staalname, bv inductie genen

– RNA degradatie door endogene (in staal) of exogene (van buitenaf) RNAsen

– DNA contaminatie: scheiding DNA/RNA meestal onvolledig

● Staalname:

‒ Keuze anticoagulans (antistollingsmiddel): best EDTA, heparine inhibeert DNA/RNA
reacties met PCR

‒ RNA stabilisatie: RNA degradatie en/of inductie voorkomen:

→ Onmiddellijk verwerken of invriezen in vloeibare stikstof (-196°C). Pas daarna kan je
het DNA stabiliseren.
→ Totaal bloed: vacuümtube met RNA bewaarmiddel, bv PAXgene tube.
→ Cellen/weefsel: RNA bewaarmiddel.
- bv RNAlater (ammoniumsulfaat oplossing). Dit precipiteert eiwitten. Dat betekent dat
de eiwitten gaan neerslaan en zo niet meer RNA kunnen afbreken of wijzigen. Dit
moet je verwijderen voor extractie,.
- of Trizol (= al eerste stap van extractie)

● Staalverwerking: RNAse-vrij werken!

– Zeer zuiver werken: dat betekent labojas en handschoenen om stalen te beschermen,
afgebakende labo/bench-zone voor RNA werk, een RNAse schoonmaakproduct (RNAse ZAP)
gebruiken voor de oppervlakten & pipetten.

‒ RNAse vrije filter-pipettips en plastics

‒ Nuclease-vrije oplossingen/water:

- gefilterd water (Milli-Q), RT-PCR grade water (getest op RNAsen)
- behandeling met RNAse inhibitoren
■ DEPC (diethyl pyro carbonaat, carcinogeen): reageert met amines in
aminozuren, voornamelijk histidine, in de katalytische site van RNAsen en
inhibeert deze (Tris is een amine, en dus werkt DEPC niet in een Tris-buffer)
■ nieuwere RNAse inhibitoren (minder carcinogeen)
● Bewaring

‒ RNAse-vrij water (of TE-buffer, maar EDTA inhibeert RNAse niet. Het inhibeert wel
DNAsen)

‒ bewaring tot 1 jaar op -80°C (minder lang dan DNA)

, ‒ langere bewaring eventueel als alcohol precipitaat

‒ beter: meerdere aliquots staal in RNA bewaarmiddel voor latere RNA extractie bewaren

● DNA contaminatie

Is niet altijd een probleem, bijvoorbeeld niet wanneer de toepassing onderscheid maakt
tussen DNA/RNA

‒ Detecteren: RTmin controle & Elektroforese

– Verwijderen: DNAse behandeling

‒ DNase toevoegen tijdens RNA extractie of behandeling van al geëxtraheerd RNA
‒ DNase knipt dsDNA en ssDNA of alleen dsDNA bij dsDNA-specifieke DNAsen
‒ Inactivatie (hitte) of verwijdering DNAse na behandeling
Het nadeel aan deze behandeling is het mogelijke verlies of degradatie van RNA.




2.3.2 RNA extractie

Methode =
- afhankelijk van startmateriaal (weefsel, bloed, bacteriecultuur, virussen,.....)
- afhankelijk van doel (hoeveel nodig, welke kwaliteit, ...)
Essentiële stappen:
1. Lysis = weefsel/cellen afbreken zodat RNA vrijkomt. Lysaat = vloeistof met inhoud van
gelyseerde cellen, goede homogenisatie belangrijk.

2. Isoleren = RNA uit het lysaat halen of opzuiveren (zonder eiwitten, eventueel zonder DNA)

3. Oplossen = RNA in gewenste type en hoeveelheid vloeistof oplossen, daarbij
concentreren.

, Lyseren:

De eerste stap is de extractie van DNA (Hfdst 1.13), RNA (Hfdst 2.3) of eiwitten (Hfdst 2.4)

Verschillende methoden, afh. van weefsel/celtype, volume en aantal stalen, moleculen en
toepassing.

- Vaak de toevoeging van remmers van niet-gewenste moleculen, bv DNAsen, RNAsen,
proteasen.
- De meest gebruikte methode is het toevoegen van detergenten, bv. SDS, Trizol (guanidium
thiocyanaat), guanidium chloride, …
- Snel vriezen en ontdooien maakt de cel kapot: lyseren is het tegenovergestelde van
cryopreservatie om cellen intact/leefbaar te houden.
- mechanische homogenisatie:

‒ pletten in vloeibare stikstof tot poeder in mortier met pestel. wordt gebruikt om weefsel
stuk te maken.

‒ bead-gebaseerde homogenisator: beads (= kralen, keramisch/metaal/glas) + schudden
aan hoge snelheid.

- vloeibare (liquid) homogenisatie:

‒ Dounce homogenisator of “Douncer”: oplossing tussen glazen pestels

‒ voordeel: mild, laat celfracties (organellen) intact

- sonicatie (geluidsgolven):

- nadeel: kan ook DNA/RNA fragmenteren

- gebruikt voor gewenste DNA fragmentatie

2.3.2.1 RNA extractie met organische solventen
meest gebruikte detergent bij RNA is Trizol

● Trizol = acid (zuur, pH = 4-5)
● Guanidium thiocyanaat – fenol – chloroform
● Guanidium thiocyanaat zorgt voor cel lysis en is een RNAse inhibitor die zou het RNA intact
gaat laten.
● Toevoegen, goed mengen, RNA nu gescheiden van DNA en eiwitten
- organische laag bevat de eiwitten en lipiden
- interfase laag bevat DNA
- waterlaag bevat RNA → kunnen we afnemen en overbrengen naar een andere tube
en zo verder gaan met ofwel alcohol precipitatie ofwel kolomchromatografie
● Voordeel: eenvoudig, goedkoop, zeer goede opbrengst en zuiverheid

Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:

Qualité garantie par les avis des clients

Qualité garantie par les avis des clients

Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.

L’achat facile et rapide

L’achat facile et rapide

Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.

Focus sur l’essentiel

Focus sur l’essentiel

Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.

Foire aux questions

Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?

Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.

Garantie de remboursement : comment ça marche ?

Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.

Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?

Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur SarahSilke. Stuvia facilite les paiements au vendeur.

Est-ce que j'aurai un abonnement?

Non, vous n'achetez ce résumé que pour €3,99. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.

Peut-on faire confiance à Stuvia ?

4.6 étoiles sur Google & Trustpilot (+1000 avis)

80364 résumés ont été vendus ces 30 derniers jours

Fondée en 2010, la référence pour acheter des résumés depuis déjà 14 ans

Commencez à vendre!
€3,99  4x  vendu
  • (0)
  Ajouter