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Samenvatting Methoden in het biomedisch onderzoek Hoofdstuk 12 Celbiologische methoden
- Établissement
- Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Samenvatting hoofdstuk 12 Celbiologische methoden
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Methoden in biomedisch onderzoekHoofdstuk 12: celbiologische methoden
Flow cytometrie
Principe zoals FACS, maar geen scheiding van cellen analyse van merkers
o Doel: bepalen hoeveel % merker de cellen bevatten
Eiwitten van interesse (merkers) worden aangekleurd met fluorescent gelabeld
antilichaam
Intra-cellulaire merkers en/of cel oppervlakte merkers
1 of meerdere merkers worden tegelijk geanalyzeerd (afhankelijk van aantal lasers
en kanalen)
Resultaten worden geplot in histogram of scatter plot voor enkele duizenden cellen
Celproliferatie
BrdU test
o Doel: celproliferatie meten
o Principe: Bromodeoxyuridine (thymidine uit S-fase) toevoegen aan cellen en laten
permeabiliseren, dan een gemerkt anti BrdU antilichaam toevoegen meten
Celleefbaarheid
MTT test
o Doel: aantal levende cellen meten
o Principe: MTT is geel en oplosbaar dat door mitochondriën (dehydrogenase) word omgezet
naat paars onoplosbaar formazan kleuring evenredig met aantal cellen meten door
optische densiteit/absorbantie
Celdood
Tunel test
o Doel: meten van apoptose
o Principe: apoptose gaat gepaard met DNA fragmentatie, kan gedetecteerd worden via
inbouw van Bromo-dUTP (Br-dUTP) in DNA door Terminaal deoxynucleotidyl Transferase
(TdT) detective met fluorescentie of kleuring
Propidium Iodide(PI) flow cytometrie
o Doel: dode cellen tellen
o Principe: PI kan enkel dode cellen binnendringen en word fluorescent na intercalatie met
DNA
Annexine V/Propidium Iodide flow cytometrie
o Doel: levende, vroeg apoptotische en dode cellen onderscheiden en tellen
o Principe: PI kan alleen dode cellen binnendringen, intercaleert met DNA en wordt
fluorescent. Bij start apoptose flipt fosfatidylserine van de cytoplasmatische zijde van de cel
membraan naar de buitenzijde, zodat gelabeld annexine V kan binden aan fosfatidylserine.
Celcyclus
PI flow cytometrie op gepermeabiliseerde cellen
o Doel: cellen in verschillende fasen onderscheiden en tellen
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