Resume
Samenvatting Methoden in het biomedisch onderzoek 1 Hoofdstuk 11 Elektroforese en Western blot
- Établissement
- Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Samenvatting hoofdstuk 11 Elektroforese en western blot
[Montrer plus]
Aperçu du contenu
Methoden in biomedisch onderzoekHoofdstuk 11: elektroforese en western blot
Introductie elektroforese
Principe
o Systeem:
elektrisch veld doet geladen deeltjes bewegen
gel werkt als zeef
scheiding volgens lading en/of massa (= grootte)
o Twee gelsystemen
Agarose gel =
Polysaccharide: polymeer van agarobiose, akomstig van zeewier en niet-
toxisch
Horizontale gels die aan scheiding van nucleïnezuren (DNA/RNA) doen
Polyacrylamide gel
Cross-linked polymeer van acrylamide (acrylamide = neuro-toxisch)
Verticale gels dia aan scheiding van eiwitten doen met een kleinere
poriegrootte dan agarose gel Scheiding van kleine DNA fragmenten
Scheiding van nucleïnezuren op een agarose gel
Werkwijze
o Gieten van de gel
agarose poeder met buffer opwarmen -> agarose smelt (buffer: TAE (Tris-acetaat-
EDTA) of TBE (Tris-boorzuur-EDTA))
afkoelen in gel tray met kam
o Staalvoorbereiding: mengen staal met laadbuffer
kleurstof om migratie staal te volgen (bromofenolblauw, xyleencyanol)
glycerol om staal zwaarder te maken dan elektroforesebuffer
o Gel laten lopen
o Visualiseren eiwitten via eiwitbindende stoffen
Toegevoegd bij het maken van de gel of gekleurd na lopen gel
Ethidiumbromide (EtBr)
zichtbaar signaal onder UV licht (DNA schade)
zeer gevoelig (detecteert band 1-5 ng DNA)
toxisch en mutageen/carcinogeen
SYBRsafe
zichtbaar onder blauw licht (en UV)
zeer gevoelig (detecteert band 1-5 ng DNA)
minder mutageen (maar wel toxisch en met nodige voorzichtigheid
hanteren!!!!)
Toepassingen
Nakijken lengte DNA fragment (ladder als referentiepunt)
Scheiden van DNA fragmenten voor opzuivering
Nakijken integriteit van RNA (intacte 28S en 18S ribosomaal RNA banden in
eukaryoot RNA)
, Polyacrylamide gel elektroforese (PAGE)
SDS-page = scheiding van eiwitten volgens massa
o Principe
Gevouwen (natieve) eiwitten met positieve en negatieve ladingen denaturatie
SDS = sodium dodecyl sulfaat, een ionisch detergent dat bind aan aminozuren en
ontvouwt eiwitten en zorgt voor een uniforme negatieve lading
Ongevouwen lineaire structuur met negatieve lading proportioneel aan lengte (en
dus massa) van het eiwit
o Twee gels
Stacking gel : bovenaan met lager percentage PA, concentreert het staal voor het in
scheidingsgel terecht komt
Betere resolutie scheiding en scherpere banden
Scheidingssgel : onderaan, een hoger percentage PA dat vast of in een gradiënt kan
zijn, scheiding van eiwitten volgens lengte
Isoelectric focussing (IEF) = scheiding van eiwitten volgens lading
o Lading
De lading van een eiwit is afhankelijk van de aminozuursamenstelling (Lys, Arg, His
maakt positief terwijl As of Glu negatief maakt)
De lading van de aminozuren is afhankelijk van de pH wat betekent dat in sommige
pH milieus het eiwit toch geen netto lading heeft isoelektrisch punt
Omdat de aminozuursamenstelling dit punt bepaalt kunnen we via die gegevens
scheiden
o Denaturatie
Zodat alle aminozuren kunnen worden blootgesteld aan de omgevng
Gel nodig met geïmmobiliseerd pH gradiënt
2D elektroforese = scheiding in twee dimensies voor complexe mengsels (IEF en SDS-PAGE elk in een
dimensie)
o Voordelen:
Goede resolutie van eiwitten: 2000 spots per gel die nog te verbeteren zijn via
prefractionatie (cel fractionatie, chromatografie, pH regio’s,…)
Detectie posttranslationele modificaties
Detectie van eiwitten die al dan niet aanwezig zijn in verschillende stalen
o Nadelen
Niet geschikt voor hydrofobe eiwitten (bv. Membraaneiwitten)
Beperkt door pH regio
Analyse en kwantificatie zijn moeilijk
Beperkte hoeveelheid eiwit kan geladen worden
Native PAGE = scheiding volgens lading, massa en vorm (geen denaturatie)
o Toepassing
Opzuiveren eiwitten met enzymatische activiteit
Bepalen van quaternaire structuur eiwit (monomeer, dimeer, trimeer,...)
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur elienbloemen. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €3,49. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
Peut-on faire confiance à Stuvia ?
4.6 étoiles sur Google & Trustpilot (+1000 avis)
68175 résumés ont été vendus ces 30 derniers jours
Fondée en 2010, la référence pour acheter des résumés depuis déjà 15 ans