Aantekeningen van Deel 5 van de cursus moleculaire biologie gegeven door Vincent Timmermans. Omvat de volledige en uitgebreide uitleg van het gehele hoofdstuk. Is ook zeer belangrijk voor het geintegreerd practicum. Ik raad ook deze aan dit een keer door te lezen voor het geintegreerd practium BA2 ...
Deel 5; Inleiding recombinant DNA technologie
De basen A, T, G, C, U kennen!!!! en ook volgorde atomen
1
,2
,Algemene afspraken en formules (te kennen)
➢ Gemiddeld Mw deoxynucleotide = 330 Da
➢ Gemiddeld Mw van een basenpaar = 660 Da
➢ Mw van dsDNA = aantal bp . 660 Da
➢ Mw van ssDNA = aantal bp . 330 Da
Wat is klonering
➢ Eeneiige tweeling is een klonering
➢ Bacteriën op een agarplaat kloneren
Reproductief kloneren = Dolly het schaap
Maken van zebravissen en deze genetisch modificeren zodat ze allemaal andere kleurtjes hebben is
commercieel NIET toegelaten. Verboden om dieren genetisch aan te passen voor de fun.
Definitie Klonen 1981 = Scheiden en individuele vermenigvuldiging van een enkelvoudig element, een
stukje DNA, dat in staat is om zichzelf te gaan vermenigvuldiging vanuit een mengsel met gelijkaardige
elementen.
Definitie Klonen 1984 = Kloneren is techniek waarbij stukjes niet relevant DNA sequentie gaat
verwijderen. En voor de dissectie van relevante DNA-sequenties samenbrengen tot een gewenste groep
van DNA
Klonering vector = DNA moleculen die in staat zijn om te repliceren binnen een gastheercel en kan
gebruikt worden om te kloneren vanuit andere DNA fragmenten
Recombinant DNA molecule = molecule die gemaakt worden in proefbuis door ligeren van stukjes DNA
aan elkaar
Bacteriën hebben plasmide
Plasmide zijn circulaire DNA moleculen, dit is dubbelstrengig DNA. Plasmide dragen vaak antibiotica
resistentiegen waardoor bacterie resistent is tegen bepaalde AB.
Plasmide kan je gebruiken als vector. Plasmide dat natuurlijk voorkomt kan je isoleren uit de bacterie.
- Vector = draag molecule
Met een restrictie enzym kan je de vector fragmenteren, hierdoor gaat de vector open. Hierin kan je een
vreemd stukje DNA ligeren in deze vectoropening mbv het DNA ligase, je krijgt dan een recombinant DNA
molecule.
3
,DNA isolatie uit bacteriën
DNA bevat circulair genomisch dsDNA en episomaal een aantal plasmiden die AB resistentiegenen
dragen.
Hoe DNA isoleren:
1. Bacteriën in cultuur brengen om te groeien
2. Gegroeide culturen zuiveren door pelleteren
3. Pellets breken zodat eiwitten, suikers vetten en het DNA vrijkomen
4. DNA scheiden van de andere stoffen
Waarom is er NaCl in media aanwezig voor het groeien van bacterieculturen?
→ Zout milieu nodig om cellen in hypotone situatie te houden. De druk moet dus goed zijn.
Stap 1. DNA isolatie
Eerste stap bij het aanmaken van recombinant DNA. Je moet genomisch DNA en vector DNA isoleren uit
de bacterie / plantencel / dierlijke cel.
De isolatie van genomisch DNA (= gDNA)
- gDNA is het totaal cel DNA, wordt gebruikt als startmateriaal voor het kloneren van genen
- Het gDNA kan geïsoleerd worden uit een bacteriecultuur
1. Cellen worden opengebroken
Hiervoor zijn 2 methodes:
a. Mechanische methode
Materiaal bevriezen en dan brengen in een mortier en hieraan droogijs toevoegen. De mortier gaat de
cellen in bevroren toestand verpulveren en gDNA komt vrij
Waarom droogijs nodig? → Enzymatische reacties in een cel verlopen altijd bij 土 37 ℃. Wanneer we
de cellen gaan openbreken komen deze enzymen (=eiwitten) ook vrij en deze gaan het DNA afbreken.
Maar wanneer we droogijs toevoegen is de temperatuur te koud voor deze enzymen om te functioneren
en DNA wordt dus niet afgebroken
b. Chemische lysebuffer
Celwand verteren en gDNA komt vrij
- Plantencellen zijn moeilijk te breken op deze manier dus daarbij beter de mechanische methode
gebruiken.
4
,Stoffen nodig voor isoleren DNA:
1. EDTA
= Ethyleendiamine tetra-acetaat
Dit blokkeert werking van enzymen door het complexeren van Mg2+.
Complexeert magnesiumionen (Mg2+). Dit ion is een co-factor dat ervoor zorgt dat enzymes kunnen
werken. Enzymen hebben Mg2+ nodig om te kunnen functioneren.
Bij toevoegen EDTA ga je de Mg 2+ complexeren waardoor de Mg2+ niet meer beschikbaar is voor enzymen
en de enzymen dus niet kunnen functioneren.
2. Detergent
Wanneer je cellen gaat lyseren, komen er ook lipiden vrij. Door toevoegen van detergenten worden deze
lipiden verwijderd.
- Zeep is een detergent
3. SDS = Natriumdodecylsulfaat
4. Triton X-100
Toxisch! Wordt afgeschaft en gaan nu over op een nieuw product → Tergitol
Na lyse worden onoplosbare celdebris verwijderd door centrifugatie waardoor een helder celextract
bekomen wordt.
Bij het zuiveren van celextract heb je nog grote hoeveelheden eiwitten en RNA ook aanwezig. Je wilt
echter alleen het DNA hebben. Je wilt dus de eiwitten RNA verwijderen.
- De vetten heb je al verwijderd door toevoegen detergent
Eiwitten behandelen met protease
- Protease = zelf-verterende eiwitten die alle eiwitten in het celextract gaan afbreken tot kleine
stukjes aminozuren.
Standaard wordt een Fenol Chloroform extractie (= fenol-extractie) uitgevoerd om eiwitten het mengsel
te halen, dit denatureert eiwitten.
Na centrifugatie in epje ontstaan 3 fasen in het epje
1. Bovenaan Fase 1 → DNA in waterige fase
2. Midden Fase 2 → Eiwitten
3. Onderin Fase 3 → Organische fase, RNA
DNA breng je over in een ander epje waarin een filter aanwezig is. Na centrifugatie hiervan is het DNA
door de filter gelopen en andere deeltjes blijven op de filter hangen → Vrijwel zuiver DNA over (LET
OP: is nog wel beetje RNA aanwezig)
Vervolgens DNA zichtbaar maken op een agarosegel en vergelijken met een DNA ladder van geknipt faag
DNA. Hierop is helemaal onderaan het staal nog wat RNA waar te nemen.
Er is echter nog veel RNA aanwezig na fenol extractie.
RNA wordt verwijderd door ribonuclease ( = RNase), dit breekt het RNA af tot ribonucleotiden eenheden.
Ribonucleotiden blijven in de oplossing aanwezig.
5
,Het DNA wordt in de oplossing geprecipiteerd (= geeft neerslag) door ethanol of isopropanol in
aanwezigheid van Na2+ ionen → DNA vormt een witte vlok zichtbaar voor het oog
Deze witte vlok kan je met een klein glazen haakje ( Glas = (+) en DNA = (-) ) pakken en isoleren.
Het neergeslagen DNA wordt terug opgelost met H2O en/of TE buffer
- TE buffer = Tris.HCl, pH 7.5; 1mM EDTA
Concentratie en zuiverheid van DNA bepalen
Dit wordt gemeten door UV spectrofotometer. De UV absorptie van een DNA oplossing is
rechtevenredig met de DNA-concentratie.
OD geeft GEEN informatie over grootte DNA!!!!!!
➢ Bij 260 nm → absorptie komt overeen met een concentratie van 50 µg/mL dsDNA
𝐴 (260 𝑛𝑚)
➢ Een zuivere DNA oplossing → 𝐴 (280 𝑛𝑚)
≥ 1. 8
𝐴 (260 𝑛𝑚)
○ Als 𝐴 (280 𝑛𝑚)
≤ 1. 8 zijn er nog eiwitten of fenol aanwezig in de oplossing
𝐴 (260 𝑛𝑚)
○ Als 𝐴 (280 𝑛𝑚)
≥ 2 is er RNA contaminatie
Dit zuivere DNA laden in agarosegel en vergelijken met DNA ladder
Zoutprecipitatie: Alternatief voor Fenol Extractie
Fenol Extractie is zeer toxisch, een alternatief hiervoor is zoutprecipitatie.
Eiwitten uit het celextract worden neergeslagen door het toevoegen van een verzadigde NaCl
zoutoplossing van 3 M NaCl.
De zouten verwijderen de hydratatiemantel rond de eiwitten waardoor de eiwitten onderling gaan
interageren en neerslaan.
Restrictie enzymen
Worden geproduceerd door bacteriën als verdedigingsmechanismen tegen bacteriofagen die
binnendringen
Bacteriofagen kunnen bacteriën infecteren van dezelfde stam, maar NIET van een andere bacteriestam.
Dit omdat het faag DNA hetzelfde modificatie patroon draagt als het DNA van de bacteriestam die de faag
kan infecteren.
Bacteriofaag gaat zijn DNA inspuiten in bacterie, dit DNA kan een lysogeen of lytische cyclus aangaan
(zie P56). De bacterie gaat zich verdedigen mbv restrictie enzymen. Deze restrictie enzymen gaan het
virus DNA afbreken.
Bacterie heeft ook eigen genomisch DNA, de bacterie wilt NIET dat deze restrictie enzym het eigen
genomisch DNA gaan afbreken, maar enkel het virus DNA afbreken.
Restrictie enzymen, het restrictie-endonuclease (RE) gaat het virus DNA fragmenteren. Maar het eigen
DNA moet beschermt worden → Restrictie-modificatie systeem
6
, Restrictie-modificatie systeem
Betrekt 2 enzymen
1. DNA methylase
Belangrijk om het eigen genomisch DNA te modificeren zodat restrictie-enzymen dit DNA (het
eigen DNA) niet gaan afbreken
2. Restrictie endonuclease
Plaatsen van methylgroep (-CH3) op nucleïnezuren (NTP’s). De methylgroep kan terug worden
verwijderd door methylase.
Ze zijn sequentie specifiek, ze gaan een sequentie herkennen en daarop een knip maken.
Verschillende soorten restrictie endonuclease
1. Type 1 restrictie-endonuclease
Herkennen specifiek niet-gemethyleerd DNA sequenties maar knippen het DNA op random
plaatsen.
Vereist Mg2+ , ATP en SAM
Zijn dus NIET sequentie specifiek
2. Type 2 restrictie-endonuclease
Herkennen een specifieke sequentie in dsDNA waarna ze DNA zullen knippen in of naast deze
sequentie, dit zorgt voor fragmentatie
Vereist Mg2+ , ATP en SAM
3. Type 3 restrictie-endonuclease
Zijn dus NIET sequentie specifiek
Vereist Mg2+
!!!Enzymen hebben Mg2+ nodig om te kunnen functioneren.
Sommigen herkenningssequenties bevatten 1 of meer CpG of CG dinucleotide sequenties.
Een restrictie enzym zoals NotI dat een 8-knipper is, veroorzaakt sticky ends of (= cohesive ends).
- Sticky ends = fragmenten komen terug bij elkaar door base complementariteit
7
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur yarameijs2001. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €8,49. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
