Samenvatting moleculaire diagnostiek
1 Kwantitatieve PCR (qPCR)
1.1 Verschil tussen conventionele – en qPCR
Conventionele PCR qPCR
Detectie tijdens plateaufase, dus na afloop Detectie in real time: elke cyclus wordt de
PCR-reactie en meerdere cycli hoeveelheid PCR-product gemeten
Niet kwantitatief: veel variatie Kwantitatief
Kenmerken qPCR:
- Na of tijdens elke cyclus wordt gemeten hoeveel
PCR-product er is aangemaakt
- De PCR-producten zijn fluorescerend door binding
aan een fluorescente kleurstof of probe →
hoeveelheid fluorescentie ~ hoeveelheid van het
gevormde PCR-product
Voordelen qPCR:
- Het PCR-product moet na afloop van de reactie niet meer geanalyseerd worden
door bv. gelelektroforese → minder contaminatie doordat reactievaatje niet meer
geopend moet worden
- Mogelijkheid tot kwantificatie startmateriaal doordat hoeveelheid gevormd PCR-
product kan bepaald worden tijdens exponentiële fase
- Meerdere kleuren fluorescentie kunnen gedetecteerd worden → multiplex
toepassingen: meerdere targets in 1 reactie
Principe qPCR:
1. Denaturatie target
2. Anealing → binding primers
3. Extentie → aanmaak PCR-product en ontstaan
fluorescentiesignaal door:
▪ Binding fluorescerende DNA-bindende
kleurstoffen
▪ Afbraak hydrolisatieprobe
→ Elke cyclus zal er meer PCR-product en fluorescentie waarneembaar zijn:
o S-vormige curve
o Cyclus 1: weinig aanmaak en weinig fluorescentie
o Cyclus N: sterke toename hoeveelheid PCR-product en
fluorescentie → EXPONENTIËLE AMPLIFICATIE
o Cyclus 20-40: reactiecomponenten uitgeput en gevormde PCR-
producten remmen reactie → nauwelijks nog toename
hoeveelheid PCR-product en fluorescentie:
PLATEAUFASE
,1.2 Fluorescentie: detectie
Fluorochromen
= Moleculen die energie in de vorm van licht kunnen opnemen
1. Excitatie
2. Emissie: andere golflengte door verlies van een deel van de
energie
→ Opgelet: spectrale overlap
o Voor elk fluorochroom een kanaal met optimale golflengte
om te gaan meten
o Maxima mooi gescheiden
o Zo weinig mogelijk van een ander kanaal oppikken
1.3 Directe qPCR detectiemethoden
Door middel van fluorescerende DNA-intercallerende kleurstoffen (binden aan
dsDNA waardoor fluorescentie toeneemt):
- Ethidiumbromide (vroeger):
o Veel nadelen:
▪ Hoge achtergrondfluorescentie
▪ Mutageen
- SybrGreen (nu):
o Voordelen:
▪ Lagere achtergrondfluorescentie: ongebonden bijna geen
fluorescentie
▪ Voor elke PCR
o Nadelen:
▪ Niet specifiek: bindt ook ongewenste PCR-producten
1.4 Indirecte detectiemethoden
- Specifieker
- Enkel fluorescentie indien gebonden aan PCR-product door gebruik quencher
- 2 primers + probe (= gelabeld stukje ssDNA, complementair aan amplicon)
1.4.1 Hydrolyse probe, dual labelled probe of TaqMan probe
Principe:
1. Hybridisatie probe aan specifiek PCR-product
2. Extensie: door de 5’3’ exonucleaseactiviteit van Taq
DNA-polymerase wordt de probe afgebroken en
worden de nucleotiden 1 voor 1 verwijderd → toename
afstand tussen quencher en reporter/fluorochroom →
daling uitdovend effect → toename fluorescentie
→ Meting fluorescentie tijdens extentiefase
→ Soms binding MGB (minor groove binder) eiwit aan
3’-uiteinde:
o Binding versterkt: hogere Tm
o Kortere probes
, o Betere signaal-ruis verhouding
o Beter onderscheidend vermogen
o Tm probe gemakkelijk aanpassen
1.4.2 Molecular beacon probe
Principe:
1. Hairpin structuur via complementariteit waardoor quencher en reporter dicht bij
elkaar zitten
2. Anealing: hybridisatie obv complementariteit en energetisch gunstiger →
quencher en reporter verder uit elkaar → toename fluorescentie
3. Taq polymerase: verwijdeering probe (geen afbraak want geen vrij 5’ uiteinde) →
opnieuw hairpin structuur → geen fluorescentie
→ Meting fluorescentie tijdens anealing
Toepassingen: Multiplex toepassingen en mutatie-analyse
- Voordeel: zeer specifiek
- Nadeel: nauwkeurige bepaling dissociatie E maakt ontwerp moeilijk
1.5 Multiplex qPCR
Conventioneel:
- Verschillende fragmentlengtes
- Analyse via agarosegel
qPCR:
- Probes met verschillende fluorochromen
- Kleur ~ welk PCR-product is gesynthetiseerd
- 4 verschillende amplimeren → 4 verschillende primerparen → 4 verschillende
probes
1.5.1 Spectrale overlap emissiespectra
Spectrale overlap tussen fluorochromen:
Filters:
- Laten soms een beetje ander signaal door
- Overstralen: vals + resultaat
, 1.6 Genotyperen met molecular beacons
Molecular beacons:
- Zeer specifiek
- Speciaal ontwikkeld voor SNV-analyse
- Geen signaal indien geen 100% overeenkomst met target DNA: door hairpin
structuur vouwt de probe zich terug op indien deze niet voor 100% past
- 2 beacons nodig: 1 complementair aan ene allel en een aan andere allel
1.7 Detectie, analyse en kwantificering van qPCR-producten
1.7.1 Drempelwaarde (treshold) en Cq waarde
Treshold:
- Niveau vanaf waar alles als positief beschouwd wordt
- Grens tussen achtergrondfluorescentie en
fluorescentie door ontstaan PCR-producten
Cq:
- Cyclus waarbij staal positief wordt
- Waar drempelwaarde en PCR-amplificatiecurve
elkaar snijden
- Hoe lager de Cq, hoe meer target materiaal en
hoe minder cycli nodig
1.7.2 Efficiëntie qPCR
Afhankelijk van:
- Remmende stoffen of inhibitoren zoals ethanol, heparine, …
- Lengte target
- Secundaire structuur (hairpin) target
- Beschikbare PCR-componenten
→ Door bepalen efficiëntie: variabelen optimaliseren en effect verschillende
variabelen bepalen
Bepalen efficiëntie:
Standaardcurve 10-voudige verdunningen:
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur iamMLTer. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €4,09. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
