Autre
Module II A, B, C
- Cours
- GIP
- Établissement
- Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Ingevuld verslag van module II deel A (1-3), B en C
[Montrer plus]
Aperçu du contenu
Name and Surname: Mestdag CaraGroup: 1Cc
II. Methods and techniques in molecular biology
II.A. Genotyping of wild type and obese mice
II.A. Step 1: PCR
Datum: 13/03/23
Veiligheidsinformatie
Reagentia H-zinnen P-zinnen Belangrijkste E-classificatie Afvalcategorie
gevaren/voorzorgen
DreamTaq / / / / Biologisch
DNA afval
polymerase
(5 U µL-1)
DNA stalen / / / / Biologisch
afval
Alle andere reagentia die worden gebruikt in dit hoofdstuk zijn niet gevaarlijk of worden in dergelijk
lage concentraties of volumes gebruikt en worden als dusdanig niet als gevaarlijk beschouwd.
Wegens mogelijk contaminatie met DNA wordt al het afval tijdens dit practicum verzameld in het
biologisch afval.
Samenvatting: Er wordt altijd een labojas en veiligheidsbril gedragen in het laboratorium.
Procedure
Voor de procedure wordt verwezen naar de handleiding pagina 22 en 23. Ter verduidelijking: de
mastermix wordt gemaakt voor twee stalen dus we hebben driemaal de volumes uit de handleiding
nodig. Tijdens het uitvoeren worden wel alle producten zoveel mogelijk op het ijs gehouden.
Er werden ook short spins uitgevoerd om druppels te laten zakken in onze epjes.
Berekeningen en waarnemingen
In Tabel 1: Inhoud mastermix staan de hoeveelheden die samen de mastermix vormen.
Tabel 1: Inhoud mastermix
Reagens Hoeveelheid (µL)
Milli-Q water 38,25
10 x DreamTaq PCR-buffer 6
dNTP mix 6
OB-FW (primer) 1,5
OB-REV (primer) 1,5
DreamTaq DNA polymerase 0,75
1
,Name and Surname: Mestdag Cara
Group: 1Cc
Taken en vragen
1. Discuss our choice of PCR primers (OB-FW and OB-REV). Did we follow the general guidelines?
Argument. Provide the output of the primer software!
In Tabel 1: Overzicht belangrijkste analytische resultaten primers worden alle belangrijke
gegevens van de primers weergegeven. Deze gegevens werden bekomen uit een paar
analytische resultaten, die terug te vinden zijn in Tabel 2: analytische resultaten primers. We
gaan nu de meest belangrijke eigenschappen, genoemd op pagina 20 en 21 in de handleiding,
nagaan. Het nucleotiden aantal van beide primers ligt tussen de 15 tot 30 nucleotiden. Beide
smelttemperaturen liggen boven de 58°C. Een te hoge smelttemperatuur zorgt voor een lager
aantal in PCR-producten. De GC-content ligt voor beide primers hoger dan 40%. Er kunnen bij
beiden primers secundaire structuren voorkomen, zoals self dimers, cross dimers en hairpins.
Bij OB-FW is ∆G positief en zullen er geen hairpins spontaan ontstaan. Bij OB-REV is de vorming
van hairpins echter wel spontaan wegens de positieve ∆G. Op dit vlak is OB-FW dus een betere
primer dan OB-REV. Beide primers kunnen self-dimers vormen. Deze reacties kennen allemaal
een negatieve ∆G. Het is echter pas een probleem wanneer deze ∆G’s van de vormingsreacties
kleiner zijn dan 10% van ∆Gmax . Voor OB-FW werd er één reactie gevonden met (∆G = -7,06
kcal / mol) > (10% ∆Gmax = -4,096 kcal / mol). Voor OB-REV zijn er twee reacties: [(∆G = -6,24
kcal / mol) en (∆G = -6,31 kcal / mol)] > (10% ∆Gmax = -3,917 kcal / mol). De reacties werden
voor de duidelijkheid aangeduid met een rode kader in Tabel 2: analytische resultaten primers.
Beide primers hebben dus een risico op het spontaan vormen van self-dimers.
Kortom kan de OB-FW primer werken, maar heeft een hoge Tm. Anderzijds is OB-REV minder
efficiënt door zijn mogelijkheid om ook hairpins te vormen. OB-REV zal minder snel gaan
binden aan de template streng. Beide primers hebben ze een hoog risico op het spontaan
vormen van self-dimers.
Tabel 2: Overzicht belangrijkste analytische resultaten primers
Kenmerken OB-FW OB-REV
Aantal nucleotiden 23 20
(Richtlijn: 15-30)
Tm (Richtlijn: 52-58°C) 68,9°C 73,5°C
GC-content (Richtlijn: > 40%) 43,4% 55%
Secundaire structuren Hairpins: Tm <17°C met Hairpins: 31°C <Tm <44°C
beperken ∆G>0 met ∆G<0
Cross homologie: vermijden Self-dimers: ∆G<0; ∆Gmax= - Self-dimers: ∆G<0; ∆Gmax = -
40,96 kcal/mol 39,17 kcal/mol>0
2
, Name and Surname: Mestdag Cara
Group: 1Cc
Tabel 3: analytische resultaten primers
OB-FW OB-REV
Hairpins Hairpins
Self-dimers Self-dimers
3
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur caramestdag. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €3,99. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
Peut-on faire confiance à Stuvia ?
4.6 étoiles sur Google & Trustpilot (+1000 avis)
77988 résumés ont été vendus ces 30 derniers jours
Fondée en 2010, la référence pour acheter des résumés depuis déjà 14 ans