Dit document bevat een samenvatting van de protocollen uit de practicum lessen van moleculaire biologie. Ook de theoretische achtergrond over de GR en de opdrachten (+berekeningen) die bij de les horen zijn in dit document verwerkt.
In frame kloneren
De coderende sequentie van de glucocorticoïd receptor (GR) kan geamplificeerd worden met behulp
van de PCR. Om de sequentie geschikt te maken voor in frame kloneren wordt er tijdens de PCR-
reactie gebruik gemaakt van een template plasmide waar de cDNA sequentie van de GR al in zit. De
template bevat dus de coderende sequentie van de GR, maar deze staat nog niet in frame (met
bijvoorbeeld het GFP-eiwit waarmee het fusie-eiwit gemaakt gaat worden). Het voordeel van cDNA
ten opzichte van genomisch DNA is dat mRNA geen intron sequenties bevat.
De primers voor de PCR worden ontworpen zodat ze precies met een gedeelte van de coderende
sequentie van de GR kunnen hybridiseren. Ook bevatten de primers extra restrictie sites die
belangrijk zijn voor de digestie en ligatie van het PCR-product in het plasmide. Daarnaast bevat één
van de primers een consensus Kozak sequentie die fungeert als initiatie site in eukaryoten mRNA
transcripten. In de figuur hieronder staat het te amplificeren PCR-product met daarin het start- &
stop codon aangegeven. De blauwe gebieden geven het gebied aan waar de primer sequenties voor
worden ontworpen.
Een belangrijk punt bij deze PCR is dat de primers aan de 5’- kant sequenties bevatten die niet
complementair zijn met het ORF van de GR. Deze sequenties worden in het PCR-product ingebouwd.
Daarnaast is het belangrijk dat het stop codon zich niet in het PCR-product bevindt.
Het PCR-programma heeft een aantal kenmerken die ervoor zorgen dat de reactie zo goed mogelijk
verloopt:
o De monsters worden vanuit het ijs in een opgewarmd PCR-apparaat gezet zodat de monsters zo
snel mogelijk opwarmen tot de smelttemperatuur van 94 graden. Dit voorkomt aspecifieke
bindingen en levert specifiekere PCR-producten.
o Tijdens de eerste 4 cycli wordt een hoge annealingtemperatuur gebruikt, waardoor de primers
specifieker hybridiseren en de kans op ongewenste aspecifieke PCR-producten kleiner wordt.
o Bij de opvolgende 4 cycli is de annealingtemperatuur lager voor een efficiëntere amplificatie. Bij
een lagere temperatuur zullen er namelijk meer primers hybridiseren met het doelwit cDNA.
o Bij de laatste cycli is de annealingtemperatuur weer hoger, omdat er na verloop van tijd meer
template DNA PCR-producten zijn ontstaan en primers dan over de gehele lengte kunnen binden
wordt er een hogere temperatuur gebruikt (verlaagd de kans op aspecifieke bindingen).
Eerste ronde van de PCR: het cDNA bevat het ORF en de UTR’s. De
forward en reverse primers binden met hun 3’- uiteinde aan het cDNA.
De toegevoegde delen van de primers die niet complementair zijn met
het cDNA worden ingebouwd in het amplificaat. In de tweede ronde
worden de twee nieuwe strengen uit de eerste ronde gebruikt als
template. Nu worden de 5’- sequenties van de primers dubbelstrengs
gemaakt. In de derde ronde worden de strengen uit de tweede ronde als
template gebruikt. Dit levert een PCR-product met aan beide uiteinden
de volledige ingebouwde sequenties van de primers. Dit PCR-product
wordt vervolgens exponentieel gevormd (zie de figuur hiernaast).
, Berekenen van hoeveelheid PCR-product dat is gebruikt in een restrictie reactie: Stel je hebt 100
ng/µl product in een gemiddelde PCR-reactie, er is ongeveer 1 µg geknipt, wat is dan de concentratie
(ng/ml) van de gezuiverde fractie? De totale hoeveelheid van 1 µg wordt geëlueerd in 50 µl
elutiebuffer, dus na isolatie zou er 100/50 = 20 ng/µl moeten zijn.
Na de PCR moet het PCR-product worden gezuiverd om de PCR-buffer te verwijderen, omdat deze
anders de digestie kan verstoren. Om de uiteinden van het PCR-product en het plasmide met elkaar
te kunnen ligeren wordt er gebruik gemaakt van restrictie endonucleases die beide kunnen knippen.
Een voorwaarde waar de restrictie-enzymen waarmee wordt geknipt moeten voldoen, is dat ze niet
in het ORF mogen knippen. Na het knippen ontstaat er een overhang in beide te ligeren producten
en kunnen op deze manier perfect aan elkaar geligeerd worden.
Voordat de gedigesteerde DNA-moleculen geligeerd kunnen worden, moeten ze eerst gescheiden
worden van alle andere ongewenste resten die in het mengsel zitten (aspecifieke PCR-producten, de
multiple cloning site die uit het plasmide is geknipt, restrictie-enzymen en zouten). Dit wordt gedaan
met behulp van gelelektroforese waarna de bandjes van het insert en van het plasmide uitgeknipt
kunnen worden en gezuiverd met silica deeltjes (deze binden onder bepaalde condities aan
polynucleotiden) voor de ligatie.
Berekeningen restrictie reactie: Stel in een reactievaatje zit 1500 ng DNA met 1500 bp. Er wordt met
restrictie-enzymen geknipt die het DNA in fragmenten knipt van 1000 bp en 500 bp.
1. Hoeveel ng DNA zit er na de restrictie in het reactievaatje?
Het aantal DNA dat in het reactievaatje zit veranderd niet, alleen de grootte van de fragmenten, dus
er zit nog steeds 1500 ng DNA in het reactievaatje.
2. Hoeveel ng van het kleine fragment en hoeveel ng van het grote fragment zullen er zijn?
1500 bp /1000 bp = 1,5 > 1500 ng /1,5 = 1000 ng en 1500 bp/500 bp = 3 > 1500 ng/3 = 500 ng, dus
500 ng van het kleine fragment en 1000 ng.
3. Wat is de verhouding van de fragmenten uitgedrukt in ng?
Dit is 1:2, omdat 500 twee keer in 1000 past en er dus in verhouding 2x zoveel ng van het fragment
van 1000 is, dan van 500.
4. Hoe ligt de molaire verhouding tussen de twee fragmenten?
Dit betekent het aantal moleculen van het ene fragment ten opzichte van het andere fragment, er is
één molecuul van 500 ng en één molecuul van 1000 ng, dus de verhouding is 1:1.
Tijdens de ligatie in de praktijk moet er een molaire verhouding van 1:3 het pEGFP-Nx plasmide en het
PCR-product zijn. De DNA-moleculen zijn niet even lang en de molaire verhouding is niet hetzelfde als
de verhouding in ng. Het PCR-product is ongeveer 2x zo klein als het plasmide, bij een gelijke
hoeveelheid in ng van het PCR-product en het plasmide moeten er dus twee keer zoveel moleculen
van het PCR-product toegevoegd worden. De molaire verhouding is dus 1:2, maar als er 1,5x meer PCR-
product wordt toegevoegd dan is de verhouding 1:3 (1,5 x 2 = 3). Er moet 100 ng plasmide aan de
reactie worden toegevoegd, dus 100 ng x 1,5 = 150 ng van het PCR-product.
In theorie zijn alle pEGFP-Nx moleculen door beide restrictie-enzymen geknipt, maar in de praktijk zou
het kunnen dat de moleculen maar door één restrictie-enzym of door geen zijn geknipt. Als de
ligatiemix wordt getransformeerd in bacteriën zou het dus kunnen dat moleculen die maar door één
restrictie-enzym zijn geknipt weer terug ligeren als controle op de restrictie-enzymen zouden de
plasmiden geligeerd kunnen worden zonder PCR-product, als er goed is geknipt met twee enzymen,
dan zullen er geen kolonies ontstaan. Als controle zouden de plasmiden geligeerd kunnen worden
zonder PCR-product. Wanneer de plasmiden maar 1 keer zijn geknipt dan zullen deze weer dicht
ligeren en ontstaan er dus wel kolonies. Wanneer de plasmiden goed zijn geknipt dan ontstaan er geen
kolonies.
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur Jylan13. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €7,99. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
