Resume
Samenvatting les 4/6 van Biotechnologie
- Cours
- Biotechnologie (K09J3A)
- Établissement
- Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Samenvatting van les 4 van biotechnologie van de slides met eigen notities.
[Montrer plus]
Aperçu du contenu
Biotechnologie Les 4: Protein tags and antibodiesRecap: van DNA naar construct
,Biotechnologie Les 4: Protein tags and antibodies
- Kennis van de finale applicatie leidt de tussenliggende stappen
- Meerder manieren om EW te klonen, subklonen, tot expressie brengen en zuiveren
o Zijn allemaal correct maar sommigen meer kans om te werken of zijn sneller.
- Kloneringskuzes
o Bron van DNA
o Verschillende methodologieën voor DNA-assemblage
- Expressiekeuzes
o Keuze van expressiesysteem (en subkloneringsstrategie)
o Keuze van zuiveringstags (purification tags)
o Keuze van linkers
scFV (IgG)
= single chain variable fragment
- Fv: 3 CDR-lussen waar Ab bindingspotentieel heeft, specifiek voor een bepaald doelwit.
- Voor toepassing: maak scAb MAAR begin met DNA = ½ van Fv gecodeerd in ene gen en
andere ½ gecodeerd in ander gen DUS assembleer 2 genen.
o Samen = klein eiwit: lage glycosylering + niet giftig.
Gastheer kan E. Coli zijn
Expressie kan IPTG systeem zijn
- Hoge zuiverheid nodig
Linkers en tags
- Variëren van een paar AZ tot hele fusiedomeinen
- Tags invloed op: zuivering, lokalisatie, labeling en vouwen.
o Intein tag = sequenties die zichzelf uit een EW kunnen splitsen.
o Impact tag een gemanipuleerd inteïne, gefuseerd met CBD = chitine-binden domein.
CBD zorgt dat getagde EW efficiënt in kolom vastligt + inteïne actief
selectieve elutie van sterk gezuiverd tot expressie gebracht EW.
- Linker = elke EW-sequentie die 2 PoI’s koppelt, die samen TxL ondergaan.
Typische planning
- Plasmide bevat al regulatie van TxN.
- pET met His-tag: snelle zuivering maar niet selectief
o Alternatieve zuiveringsstrategie nodig
- EW-linkers: scheiden individuele componenten van PoI en tussen PoI en zuiveringstag.
- Nu componenten zijn bepaald, kan montage gepland worden, incl. reviseren componenten.
VH = variable heavy VL = variable light: top van IgG, samen vormen ze IgG-bindingsplaats, afkomstig
van een single Ab.
Gebruik intein purificatie tag want we willen hoge zuiverheid, beter dan His-tag.
Je weet hoe je je PoI wil hebben: je kan ook enkele componenten herzien, hier is hoeveelheid
engineering die ik in pET28 moet doen, om alle deze van constructie op te nemen, aanzienlijk kies
om met andere vector te werken (construct in 1w): reduceert probleem = 3 fragmenten ipv 5.
Captaliseer SapI-fragment of SapI endonuclease plaats voor klonering.
, Biotechnologie Les 4: Protein tags and antibodies
Kloon de laatste overhang, vanwege flexibiliteit bij samenstellen van fragment, kies ik ook type IIS.
Voorkant kies ik voor een stom uiteinde.
Codeer de linker als primeroverhang: assembleer niet meerdere fragmenten MAAR 2x PCR om
fragment te amplificeren en type IIS samen samen met blunt end kan ik klonen.
GSSGS-EW toevoegen tussen PoI en TEV-tag
- Glycine en Serine = kleine sterke polaire AZ flexibele tag genereren
kans dat TEV-tag beschikbaar is voor proteasen stijgt.
Overhang kiezen voor type IIS-klonen om niets over te laten tussen VL en
purificatie tag.
- SapI plaats in pTX1 plasmide strategisch geplaatst:
o Overhang = sequentie die codeert voor Cysteïne dat later door Inteïn geplitst wordt.
- Als je die overhangende sequentie gebruikt tot expressie gebrachte EW bij Cysteïne
afgesplitst geen enkel toegevoegd AZ blijft achter (IIS = zonder scar).
Linker tussen VL en purificatie tag om purificatie tag te verwijderen
- PT = intein-CBD: activatie inteïne splitsing en afgifte van EW = geen linker nodig.
- PT = His-tag
o Vaak zonder linker
o Indien wel linker: varieert van 1 AZ tot meer gevestigde linker en variaties daarvan.
G4S (variatie = GSSGS)
Biotherapeutische engineering
Reikwijdte
- Punt mutaties, inserties en deleties
- Chemische aanhechting van aanvullende chemische functionaliteit
- Onnatuurlijke AZ
- Tags (zuivering)
- Domein wisselingen (chimere Ab)
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur VDSA. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €7,49. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
Peut-on faire confiance à Stuvia ?
4.6 étoiles sur Google & Trustpilot (+1000 avis)
52510 résumés ont été vendus ces 30 derniers jours
Fondée en 2010, la référence pour acheter des résumés depuis déjà 14 ans