Resume
Samenvatting les 3/6 van Biotechnologie
- Cours
- Biotechnologie (K09J3A)
- Établissement
- Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Samenvatting les 3 van biotechnologie obv notities van slides.
[Montrer plus]
Aperçu du contenu
Biotechnologie Les 3: From gene to protein IIEerste stappen in discovery
Van gekend target naar therapeutisch proteïne
- Ontdekking gebaseerd op
o Assays om gezochte functie te meten
o Scheidingsmethoden: functies isoleren
o Methoden voor bepalen van identiteit van betreffende molecuul
Geïsoleerd producerend weefsel (insulinoma) van bekend potentieel therapeutisch EW (insuline)
Ga uit van in insulinoma = kankercellijn dat veel insuline produceert
- Aanname: hoog EW-niveau = hoog mRNA-niveau
o NODI voor 1e stap in protocol = RNA isoleren: guanidinium denatureert alle EW of AA
en organische extractie in een CD5 conditie terugwinning van alle RNA’s (r,t,m).
Totaal RNA extract: mRNA kleine fractie 0,3% mRNA codeert voor insuline
Extractie mRNA (RT met een hoge kwaliteit templaat) manier om insuline-mRNA eruit te halen
- Eukaryote cel: polyA-label essentieel voor terugwinnen van mRNA uit cellen.
TxL geïsoleerd mRNA: aantonen dat er insuline geproduceerd werd, gedetecteerd met Ab.
RT met polyT primer, bindt polyA staart in mRNA converteert RNA info terug in DNA.
- Geen introns in volwassen mRNA
- Labeling van terminale transferasen (TdT) om compatibele overhangen te creëren
RT verwarmen: RT denatureren + TdT
Geen SMART-primer: fixeren cellulaire polymerasen 2 e streng (cDNA gemaakt door RT)
Origineel insuline klonen
Klonen van mRNA in plasmide
- Plasmide onbekend plasmide = klassiek moleculair biologisch plasmide
- Gedigereerd met endonuclease = creëert ingangspunt
- TdT met dGTP als substraat
- Tdt geen templaat nodig, iav dGTP creëert poly-G overhang aan 3’end geen
basenparing mogelijk plasmide kan niet ligeren.
plasmide pBR3222 geknipt met PstI,
gezuiverd en geïncubeerd met Tdt + dGTP
plasmide: polyG overhangen, niet re-ligeren
Polymerase = TdT geen templaat: product afh van elke toegevoegd nucleotiden: dGTP dus enkel G.
, Biotechnologie Les 3: From gene to protein II
poly-dT pirmer bindt polyA in mRNA + RT
gesynthetiseerd cDNA behandeld met TdT + dCTP
cDNA = 50% RNA + 50% DNA
polyG en polyC overhangen zijn compatibel en kunnen ligeren
levensvatbaar plasmide gecreëerd.
Na transformatie: kolonies isoleren (degene waarvan sequentie bepaald of
gescreend werd dmv plotten om zeker te zijn dat verwachte sequentie voor
insuline EW aanwezig was)
Insuline isolatie vandaag de dag
Ingangspunt nog steeds RNA, maar snellere manieren.
A) Poly T-primer bindt polyA mRNA geeft priming-plaats die RT kan verlengen.
B) + overhangen (onbekende sequentie, zelf kizen) voor RT-primer
o RT vindt plaats
o DNA klaar + C-overhangen = verder dan DNA, maar indien + SMART-oligo met
korte G-overhang bindt het ontluikende C’s RT blijft synthetiseren tot einde oligo.
onbekende sequentie in 5’ prime van RT + bekende sequentie in SMART-oligo
maakt PCR mogelijk
C) Versnellen: biotine gelabelde primer
o Post-PCR: producten vangen mbv streptavidine-gecoate korrels + proces
stroomafwaarts versnellen.
o Kies overhangs (rood), kies primer sites (blauw)
D) Kan gesequenced, gekloond en gesynthetiseerd worden.
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur VDSA. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €7,49. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
Peut-on faire confiance à Stuvia ?
4.6 étoiles sur Google & Trustpilot (+1000 avis)
52510 résumés ont été vendus ces 30 derniers jours
Fondée en 2010, la référence pour acheter des résumés depuis déjà 14 ans