1. DNA-replicatie
1.1. Structuur van DNA
- DNA is de algemene drager van erfelijke informatie; het eerste experiment om
dit aan te tonen gebeurde door Griffith
® Griffith bestudeerde bacteriën (pneumococci); er zijn 2 soorten, nl. de
kleinere ruwe variant (R) en de grotere gladde variant (S; dit is eigenlijk
gewoon de ruwe variant met daarrond een polysaccharidenlaag),
waarvan de S-variant toxisch is
® Wanneer R in een rat werd ingespoten bleef deze leven, maar wanneer
S werd ingespoten stierf hij à experiment: S-variant koken (zodat deze
dood is) en vervolgens mengen met levende R-variant
® Wanneer enkel de gekookte (dode) S-variant werd ingespoten bleef de
rat leven, maar wanneer het mengsel van R en gekookt S werd
ingespoten stierf de rat à “transforming principle”: de ruwe variant
werd in een nieuwe gladde variant getransformeerd door genetische
overdracht van S naar R (ook al is S dood)
® Dit experiment werd herhaald door Avery, Mc. Leod en Mc. Carty, maar
in plaats van de gladde variant te koken haalden ze er verschillende
fracties uit (eiwitten, nucleïnezuren); het Griffith-experiment werkte
alleen bij het toevoegen van nucleïnezuren, niet bij het toevoegen van
eiwitten à conclusie: nucleïnezuren dragen de genetische informatie
- Ook experiment door Hershey en Chase om aan te tonen dat nucleïnezuren
de dragers van genetisch materiaal zijn
® Kweekten virussen op in een medium met ofwel S35 (radioactieve
zwavel) ofwel P32 (radioactieve fosfaat) à deze radioactieve stof werd
opgenomen en ingebouwd door de virussen zodat deze ook radioactief
werden
® Bacteriën werden geïnfecteerd met het S35- of het P32-virus; het virus
zet zich dan vast op de bacterie en injecteert zijn erfelijk materiaal, om
dit vervolgens door de bacterie te laten kopiëren
® Bacteriën geïnfecteerd met het S35-virus werden niet radioactief,
bacteriën geïnfecteerd met het P32-virus wel; het zwavel zat dus niet in
het genetisch materiaal, de fosfaat wel
® Zwavel is een component van proteïnen maar komt niet voor in
nucleïnezuren; fosfaten zijn wel een component van nucleïnezuren (en
komen soms ook voor in eiwitten) à dit experiment toonde aan dat het
de nucleïnezuren (niet de proteïnen) zijn die geïnjecteerd worden
1
,- James Watson, Francis Crick en Rosalind Franklin beschreven in 1953 voor het
eerst de dubbele helix-structuur van DNA
® Op dit moment wist men al dat DNA de drager is van
genetische informatie, maar nog niet hoe het eruitzag
® Rosalind Franklin maakte een röntgenstralendiffractiefoto van
de DNA-strengen (deze foto wordt “picture 51” genoemd),
waaruit geïnterpreteerd kon worden dat DNA een dubbele
helix is (de dubbele helix zelf is niet zichtbaar op de foto,
enkel het diffractiepatroon)
® Een collega van Rosalind Franklin, Maurice Wilkins, liet de foto zien aan
Watson en Crick, die ook al aan het zoeken waren naar de structuur van
DNA (maar ze dachten eerder aan een triple helix waarbij alle fosfaten
vanbinnen zaten) à Watson en Crick kwamen al snel op de (juiste)
dubbele helix-structuur en publiceerden dit
® Watson en Crick hebben een Nobelprijs gekregen voor hun werk,
Franklin niet (maar ze was ook al dood op dat moment)
- Ook Chargaff speelde een rol bij de ontdekking van DNA: kwam op
“Chargaff’s rule” voor DNA die zegt dat er evenveel G’s als C’s zijn en
evenveel A’s als T’s à wees op basenparing tussen G en C en A en T
® Chargaff heeft ook geen Nobelprijs gekregen
- Belang van de ontdekking van de dubbele helix-structuur: “It has not escaped
our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests
a possible copying mechanism for the genetic material” à de dubbele helix-
structuur geeft dus meteen ook een mechanisme voor DNA-replicatie, nl. een
complementaire streng aanmaken op een bestaande streng
® Examen: begin een zin met “It has not escaped my
notice” voor een extra punt
- DNA in wat meer detail (moleculaire structuur moeten we
kunnen tekenen, eventueel de basen in wat minder detail):
o 2 antiparallelle strengen
o Rechtsdraaiende dubbele helix
o Suiker-fosfaat ruggengraat
o Complementaire basenparing (3 H-bruggen tussen G en
C, 2 tussen A en T)
o 10,4 nucleotiden per winding
2
, - Er zijn 2 structuren van de DNA dubbele helix: A-DNA en B-DNA
® B-DNA is de “normale” structuur; A-DNA is wat compacter
(breder en korter)
® A-DNA komt voor als de relatieve vochtigheidsgraad lager
is dan 75%, als je een DNA-RNA-helix maakt of als je een
RNA dubbele helix maakt (wegens sterische hinder: RNA
heeft een extra OH-groep op de C2 van de ribose-eenheid)
® B-DNA heeft grote groeven en kleine groeven; de grote
groeve is breder en dieper en dit is de plaats waar eiwit-
DNA interacties meestal gebeuren
1.2. Mechanismen van DNA-replicatie
- DNA-replicatie is het kopiëren van DNA om genetische informatie te bewaren
bij celdeling; dit is een zeer betrouwbaar proces
- DNA-replicatie is een semiconservatief proces: elke streng dient als matrijs
voor de aanmaak van een nieuwe, complementaire streng (de helft van de
helix wordt dus behouden, de helft is nieuw) à dit is aangetoond met een
experiment van Meselson en Stahl
® Ze gebruikten een staal met cesiumchloride en centrifugeerden dit op
hoge snelheid, zodat een gradiënt ontstond (CsCl met hoge dichtheid
op de bodem, met lage dichtheid vanboven; het is dus niet zo dat alle
CsCl neersloeg)
® Aan dit staal werd DNA toegevoegd van bacteriën die groeiden op een
radioactief medium (zodat het DNA ook radioactief was), waarna
gecentrifugeerd werd à het DNA zette zich op een bepaalde hoogte
vast in een bandje, afhankelijk van de dichtheid
® De bacteriën groeiden daarna verder op niet-radioactieve bodem en
repliceerden eenmaal; uit deze tweede generatie werd ook DNA
gehaald en toegevoegd aan het staal à dit DNA zette zich ook vast in
een bandje, maar hoger dan dat van de eerste generatie
® Ook uit de derde generatie werd DNA gehaald en toegevoegd aan het
staal à dit DNA zette zich vast in 2 bandjes, 1 op dezelfde hoogte als
generatie 2, 1 nog hoger
® Ook uit de vierde generatie werd DNA gehaald en toegevoegd aan het
staal à dit zette zich vast in 2 bandjes op dezelfde hoogtes, maar het
hoogste bandje was dikker
® Verklaring: het eerste generatie-DNA is zwaar (radioactief) en zakt dus
diep weg; het tweede generatie-DNA bestaat uit 1 streng zwaar
radioactief DNA en 1 streng licht DNA en zakt dus iets minder diep weg;
voor de derde generatie zijn er 2 opties, nl. een dubbele helix
bestaande uit een zware en een lichte streng of een dubbele helix
3
, bestaande uit 2 lichte strengen, zodat er 2 bandjes vormen op 2
hoogtes; voor de vierde generatie zijn er ook 2 opties, maar de zwaar-
licht dubbele helix heeft een relatief voorkomen van 1/4 en de licht-licht
dubbele helix van 3/4, zodat er 2 bandjes vormen waarvan het bovenste
dikker is à in verdere generaties zal het percentage licht-licht nog
verder stijgen
- Voordeel van de dubbele helix: de informatie komt dubbel voor à als er iets
misgaat in 1 streng (beschadiging van het DNA) dan kan dit hersteld worden
door af te kijken van de andere streng
® Dit is het proeflees-mechanisme
® Opmerking: verwar dubbele helix niet met diploïdie (= dubbel
voorkomen van elk chromosoom)! Haploïde organismen hebben ook
een dubbele helix, maar elk chromosoom komt maar eenmaal voor
- Algemene beschouwingen bij DNA-replicatie:
o Het DNA wordt eerst plaatselijk ontwonden mbv. het enzym helicase,
om zo toegang te krijgen tot de basen; hierbij is ATP nodig (om de H-
bruggen te verbreken)
® Dit ontwinden veroorzaakt torsiekrachten in het DNA;
topoisomerasen (I en II) zorgen ervoor dat de extra spanningen in
het DNA worden opgevangen
o DNA-replicatie is een zeer accuraat proces, o.a. door het proeflees-
mechanisme van DNA-polymerase
o DNA-replicatie is een zeer snel proces
® Dit is noodzakelijk: elke keer dat een nieuwe cel wordt aangemaakt,
moet DNA gerepliceerd worden
o DNA-polymerase werkt altijd van 5’ naar 3’ à de 2 DNA-strengen
worden op verschillende manieren gerepliceerd (continue en
discontinue replicatie)
- De “hoofdrolspelers” in DNA-replicatie zijn dus:
o DNA-polymerase: zorgt voor het kopiëren van DNA
o Helicase: zorgt voor het “smelten” (ontwinden) van DNA
o Topoisomerase: controleert supercoiling
o Multifunctionele complexen: zorgen voor coördinatie
4
