Resume
DEEL 2 gento samenvatting
- Cours
- Gentechnologie (I0O11A)
- Établissement
- Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Uitgeschreven lesnotities die complete inhoud van de cursus vormen
[Montrer plus]
Aperçu du contenu
HOOFDSTUK 66.1 INLEIDING: COMPLEXITEIT VAN GENOMISCHE BANKEN VS CDNA BANKEN
2 verschillende zaken en technieken dus ook zeer specifiek.
4 stappen:
1. Hoe aanmaken
2. Hoe koppelen aan vector
3. Hoe binnenbrengen in bepaalde gastheercel
4. Eens bank verkregen, hoe screenen?
Onderscheidt tussen beide banken goed begrijpen. De complexiteit van een genoom bank is totaal anders dan
cDNA library. DNA molecule, relatief stabiel en we gaan een homogene vertegenwoordiging hebben van alle
fragmenten die erin voorkomen. cDNA bank afgeleid van mRNA, die mRNA status is niet stabiel. Helemaal
overgerepresentateerd voor bepaalde coderende sequenties. Heel veel delen uit genoom die er als introns zijn
uitgespliced of niet coderend zijn. Zal dus heel variabel zijn afhankelijk van de condities en het tijdsmoment
waarop men RNA stalen gaat maken. Vanuit een celpopulatie enerzijds, hoog moleculair gewicht DNA,
chromosomaal DNA gaan nemen en fragmenteren is een totaal ander gegeven dan vanuit die zelfde tissue
mRNA gaan maken, cDNA te converteren en dan om te zetten naar fragmenten. Nadien gaan we wel banken
maken, maar de eigenschappen gaan verschillen vanwege het vertrekpunt
Samenvattend:
Genomisch representatie van het hele genoom, kwantitatief egaal, tov de relatieve representatie van mRNA’s
en hoeveel ze voorkomen in populatie. Toch is het naast een genomische bank toch interessant om een cDNA
bank te maken en analyseren omdat het u zicht geeft over expressie informatie en kan ook voordeel zijn dat
introns er zijn uitgespliced. We gaan voor een stuk de complexiteit reduceren omdat maar een kleine fractie
van het genoom tot expressie komt. Maar complexiteit wordt dan terug verhoogd door verschillen in
expressieniveaus. Het is dus volledig niet uniform en sommige mRNA’s zijn die enorm hoog abundant zullen
zijn.
6.2 STAPPEN BIJ DE BEREIDING VANGENOMISCHE BANKEN
FRAGMENTATIE & FORMULE VAN CARBON EN CLARKE
Bereiden en stappen maken van DNA fragmenten
1. Restrictie-endonuclease: voordeel dat ze wel gedefinieerde, precise uiteindes hebt, sticky uiteindes
die gemakkelijk te kloneren zijn .
2. Partiele digestie
3. Mechanische shearing: fysisch breken van DNA staal en dat doe je door het op ijs met tip van
sonicator. Deze tip zorgt ervoor dat DNA fysisch gaat breken. Hoe langer en intenser, gaat ervoor
zorgen dat meerderheid DNA fragmenten worden gedegradeerd. Conditie 7: meerderheid tussen 2kb
en 5kb gelegen. Waar DNA breekt is volledig random. Deze randomness is belangrijk!. Hebben dit niet
met RE want daar afhankelijk van herkenningsplaatsen. Hier random fragmenten. Meestal hier de
bedoeling, door gebruik te maken van 2 enzymatische activiteiten: exonuclease activiteit en
polymerase activiteit. Da je u DNA fragmenten gaat polishen.
34
, 5’ uitstekende uiteindes, betekent dat 3’OH nog een gebied heeft waar een polymerase een inbouw
zal doen van nt zodat we een blunt uiteinde bekomen. In het ander geval een 3’ overhangend
uiteinde, aan 5’ niks verlengen. Maar door exonuclease activiteit kunnen we de uiteindes afknippen
zodat al deze gevormde fragmenten een blunt uiteinde hebben.
Wat is de relatie? Hoeveel kloons (n) hebben we nodig om een bank met een gemiddelde insert grootte te
genereren, gegeven dat we genoomgrootte G kunnen schatten.
Aantal kloons in u bank, je gaat op een bepaalt moment willen screnen. Ge moet zeker zijn dat de
screningsmethode dat je gaat gebruiken, dat aantal kloons dat we hier kunnen screenen dat dat haalbaar is.
Genoom:
Relatie: hoe groter gemiddelde insertgrootte, hoe minder aantal kloons nodig gaan zijn maar hoe groter
fragment. Natuurlijk hoe groter uw genoom hoe groter aantal kloons. Allemaal vervat in formule van carbon
and clark. Deze zal complexiteit van random bibliotheek gaan beschrijven. Wanneer u bibliotheek gemaakt is
door elektrische shearing dan is deze formule bruikbaar. Wanneer de bank is gemaakt doormiddel van een
partieel digest, RE dan verliest men deel van de randomness maar blijft het nog steeds een vrij goede
benadering.
Om bepaalde representativiteit van de bank te hebben wordt statistisch benaderd en geeft dus ook een
waarschijnlijkheid dat weergegven wordt via de formule 1-(1-f)^N. Deze formule kan omgevormd worden.
Als mn naar een bepaalt gen of locus in E. coli op zoek zijt, dat mn inhet geval van een cosmide library u
screening moet gaan uitvoeren op een 430 kloons. Bij N = 20 dan iets minder dan 1000 kloons. Wat is het
beste? Dit moet je zelf inschatte. Op zoek naar locus van 1-2kb dan is het mss interessanter om grotere library
te screenen met kleinere insert grootte.
LIGATIE & FRAGMENTATIE (DEEL 1)
Binnen genoom library die we kunnen knippen of shearen. Na shearen → polishen, kunnen we gaan ligeren in
onze vector. Verschillende strategiën:
- Terminaal deoxynuclytidyltransferase die fragmenten met homopolymeren staarten zal voorzien,
kunnen gehybridiseert worden. Dat is een methode dat niet zoveel gebruik wordt.
- Traditionele methode: via cohesieve uiteindes of sticky uiteindes eigenlijk onze ligatie te gaan doen.
Eerst vetrekken van onze plasmidevector waar we in de MCS unieke splitsingsplaatsen hebben zodat
35
, we cohesive ends gaan genereren. Als we dan genomisch DNA gaan knippen met RE dat dezelfde
uiteindes geeft, kunnen we dit ligeren en zo recombinanten gaan bekomen na transformatie.
Zelf ook aanvoelen dat het risico op geen insert hier relatief groot is, dat het plasmide hier zelf zal sluiten en
truck om dit te vermijden. Bv. Als we 3’ uiteinde beetje gaan verlengen in aanwezigheid van dTTP en dCTP en
een polymerase zoals klenow polymerase, dan zullen er T’s en C’s complementair worden ingebouwd en zitten
we hier met een TC overhang aan beide strengen dus zullen nooit zelfsluiten.
Als we dit doen met vector zal deze nooit kunnen herassocieren. Als we dan bv ons vreemd DNA, een partieel
digest gaan doen met sau3A waardoor we een GATC overhang gaan creeren en die behandelen met klenow
polymerase in aanwezigheid van dGTP en dATP, creeren we een GA overhang zodanig dat alle
insertfragmenten ook niet met elkaar kunnen ligeren? Enigste combinatie dat werkt is wanneer een
insertfragment gaat associeren met een vector fragment. Dit is veel sterker dan defosforylatie!!
Dan komen we terug bij de staart PCR waarbij we ons annealingsgedeelte van de primer, de woelwitregio,
gaan afbakenen en aan het 5’ uiteinde nog een extra staart hangen die na amplfiicatie ervoor zal zorgen dat
we onze target regio hebben maar geflankeerd met die staarten in dubbelstreng waarbij we dus een
restrictieherkenningsplaats naar keuze kunnen inbouwen. De essentie is hier dus dat hier zuiver door de
primer staarten eender welk uiteinde kunnen genereren, dat we dan terug kunnen knippen met RE zodat we
zeker zijn dat we een directionele klonering kunnen doen in bv. Plasmidevector
We hebben het ook al gehad over linker molecules, kan nuttig zijn wanneer we blunt uiteindes hebben. Als
blunt DNA wordt gekoppeld aan linkers in aanwezigheid van t4 DNA ligase, kunnen we splitsen met EcoRI en er
zo voor zorgen dat we toch via die linkers ons sticky uiteindes krijgen om een efficiente ligatie te verkrijgen.
Deze adapters hebben we ook al gezien als we blunt uiteindes hebben en we gaan zo een adapter molecule
eraan hangen dat hier al een overhnag heeft alweer met T4 DNA ligase zo er nu 1 adapter molecule gaan
aanhangen dat we kunnen gaan fosforyleren om zo een efficiente klonering te krijgen.
36
, LIGATIESTRATEGIEËN & TRANSFORMATIE (DEEL 2)
OVERZICHT VAN GENOOMBANKEN
Andere methode dat een blunt ligatie vermijdt is mogelijk dankzij taq polymerase. Deze heeft ook een
terminaal nucleotidyltransferase activiteit wanneer je bv een doelwit DNA gaat amplificeren en op het einde
van PCR reactie het Taq polymerase nog 20 min laten werken, dan zal die exact 1 extra A’tje hangen aan het
PCR product.
Extra A’tje is belangrijk want zal ervoor zorgen dat PCR producten niet met elkaar gaan concatemeriseren en
het enigste dat zal gebeuren is een ligatie wanneer uw vector een nT overhang heeft. Ligatie kan op
verzchillende temperaturen gebeuren en verschillende duren afh of het sticky of blunt end is. Maar er bestaat
nog 1 methode die nog sneller gaat en toe laat op 5 min bij Kt een TA clonering te laten opgaan
TOPO-GEMEDIEERDE KLONERING
Meestal een commercieel beschikbaar systeem waarbij men eigenlijk uw vector koopt en die is zo voorbereidt
dat deze gelineariseerd is, een T overhang heeft en bovendien een covalente koppeling van DNA aan TOPO-
isomerase 1 enzyme. Die koppeling activeert eigenlijk de ligatie reactie die wordt gemedieerd doordat TOPO
isomerase dat er is aan gekoppeld en da zal ervoor zorgen dat dit fragment wordt gerecruteerd en eigenlijk op
een 5 tal minuten bij Kt ene ligatie zal gebeuren. Er zijn verschillende types, deze afh van hoe ze gekoppeld
zijn.
+:
- Snel en effiicent
-:
- iets duurder systeem
- Afhankelijk van leverancier die specifieke vector tot beschikking hebben
Dit systeem heeft hetzelfde principe:ook koppeling van vector aan topo-isomerase I. Deze bindt aan CCTTT
regio en creert een overhang; Aan de andere kant blunt fragment en dat wil zeggen dat we directioneel ons
fragment kunnen insereren. Enigste wat we moeten doen is een tail PCR die CAGG overhang creert en tijdens
die ligatie zal dit fraglent verplaats worden en zo een insertie van een sticky uiteinde aan 1 kant, blunt aan de
andere kant. Heel efficient, meer dan 90% van de kloons zal werken.
Ons genoom gaan we splitsen door partieel digest ofwel door shearing en de kloons die we daardoor
bekomen, in tegenstelling tot echte puzzel gaan overlappende fragmenten zijn.
6.3 CDNA KLONERING & CDNA BIBLIOTHEKEN
INLEIDING
Wanneer we een cDNA bank gaan maken zal dat een bibliotheek zijn van genen die tot expressie komen in een
bepaald weefsel onder specifieke condities op een bepaald tijdspunt. Daar is niks random of homogeen aan
want onder die specifieke condities zal er altijd een relatieve vertegenwoordiging zijn van mRNA’s die hoog
abudant, laag abundant of daar tussen in tot expressie komen en dat kan varieren.
37
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur mathieucnudde. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €10,39. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
Peut-on faire confiance à Stuvia ?
4.6 étoiles sur Google & Trustpilot (+1000 avis)
74534 résumés ont été vendus ces 30 derniers jours
Fondée en 2010, la référence pour acheter des résumés depuis déjà 14 ans