Dit is een samenvatting van hoofdstuk 13 uit het vak methoden in het biomedisch onderzoek 1 - analyse va het DNA.
Gebaseerd op de lessen en slides, bevat figuren uit de powerpoint.
2. DNA extraheren
Algemeen principe
1. Lysis = afbreken van cellen zodat het DNA vrijkomt
→ lysaat = vloeistof met inhoud van gelyseerde cellen
2. Isoleren = DNA uit het lysaat halen of opzuiveren
→ RNA en eiwitten verwijderen
3. Oplossen = DNA in gewenste type en hoeveelheid vloeistof oplossen, hierbij
concentreer je het DNA ook
Lyseren
- Vaak toevoegingen:
o Remmers van niet-gewenste moleculen: RNasen, proteasen,…
o EDTA = complexeert Mg2+ waardoor die wordt afgeschermd van DNase → DNase
inactief, anders wordt DNA afgebroken
- Lysis mbv detergent
o Meest gebruikte methode → snel, reproduceerbaar, geen specifieke apparatuur
o Bij celculturen toegepast
o Hydrofiele kop en hydrofobe kop
Verdund voorkomen: monomeer
Hoge concentratie in oplossing: micelle met hydrofiele koppen naar
buiten en hydrofobe staarten naar elkaar gericht
, o Milde detergent (CHAPS, triton, ...)
= behoud van celorganellen mogelijk + tragere lysis
o Harde detergent (SDS, …)
= ook organellen worden opengebroken + proteïnedenaturatie
o Principe van detergent
Lipiden monomeren nestelen zich in het lipiden dubbelmembraan
Buitenste membraan wordt langer als binnenste → membraan krijgt licht
kromming
Op een bepaald moment: te harde buiging en membraan knapt open →
gaten in membraan
Langs opening gaten worden er eerst halve micellen en uiteindelijk hele
micellen gevormd
- Mechanische methoden voor lysis
o Voor DNA is dit vaak te bruut, daarom dat men meestal detergenten prefereert
o Sonicator: hoge frequentiegolven maken ook het DNA kapot → vermijden als je
DNA wilt analyseren
- DNA uit bloed lyseren
o Anticoagulans = anti-bloedstolling → EDTA, want heparine inhibeert DNA reacties
o NH4Cl → lyseert cellen zonder kern (bv RBC → heemgroepen kunnen verdere
analyse inhiberen)
o Men wilt de WBC → met kern en dus DNA
→ verder gaan zoals bij de cellen
- DNA uit weefsels lyseren
o In kleine stukjes disseceren
o Met vloeibare stikstof → in mortier met pestel pletten tot een
poeder
, → verder gaan zoals bij cellen
- DNA uit cellen lyseren: met buffer
o SDS = detergent → afbreken membraan + eiwitten
o Enzymes: eiwitten en RNA afbreken
o EDTA: complexeert Mg → inhibitie DNase
DNA isoleren
- Organische solventen
o Scheiding DNA, RNA en eiwitten op basis van verschillende oplosbaarheid in
verschillende niet-mengbare vloeistoffen
o Voeg phenol-chloroform-isoamyl extractie toe + vortex (mengen)
Phenol → denatureert eiwitten + minder polair dan water waardoor DNA
hier niet zal in oplossen
Chloroform → verhoogt efficiëntie van eiwit denaturatie + denatureert
lipiden
Isoamyl → vermindert schuimvorming
o Centrifugeer
Pellet = organische fase met lipiden + interfase met proteïnen
Supernatans = waterige fase met DNA
o Breng waterige fase over in nieuwe eppendorf
→ nadeel van deze manier: restanten van organische solventen in DNA + stoffen zijn
corrosief en toxisch
- Geconcentreerd zout
o Principe
Voeg NaCl toe en centrifugeer → onttrekt sneller water van rond de
eiwitten dan rond DNA → eiwitten slaan neer en vormen pellet
Supernatans bevat DNA → overbrengen naar nieuwe eppendorf
o Voordeel: eenvoudig, goedkoop en goede opbrengst & zuiverheid
o Na salting out & na phenol-chloroform extractie → ethanol precipitatie
(neerslaan van DNA) voor verdere opzuivering en concentratie van DNA (zie
verder)
- Kolomchromatografie
o Principe
Bepaalde condities van zout en pH zorgen ervoor dat DNA aan matrix van
kolom bindt
Andere condities zorgen voor elutie = vrijzetten van DNA
o Drijvende krachten van beweging doorheen kolom
Centrifugatie
Zwaartekracht
Vacuüm
o Verschillende types
Silica kolom
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur laurebrants. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €3,99. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
