Samenvatting van hoofdstuk 11 uit het vak Methoden In Het Biomedisch Onderzoek 1. Dit hoofdstuk gaat over Elektroforese en Western Blot.
Samenvatting gemaakt aan de hand van de slides en de hoorcolleges.
Hoofdstuk 11: elektroforese en western blot
→ belang: technieken om (specifieke) biomoleculen van elkaar te scheiden
1) Introductie elektroforese
- Principe: scheiding van geladen deeltjes op basis van grootte doordat ze doorheen een gel
worden gestuurd onder invloed van elektrisch veld
o Elektrisch veld: laat geladen deeltjes bewegen
o Gel: 3D matrix die als een zeef werkt
- 2 gelsystemen:
o Agarose: polysacharide → scheiding van nucleïnezuren
Horizontale gel
Niet-toxisch
o Polyacrylamide: cross-linked polymeer van acrylamide → scheiding van eiwitten
Acrylamide + methyleenbisacrylamide (=cross linker) + katalysatoren (=
TEMED of ammonium persulfaat
Verticale cel + kleinere poriegrootte
Onbewerkte acrylamide = neurotoxisch
Denaturerende condities of natief
Denaturerend = 3D structuur van eiwit wordt afgebroken: je
analyseert de lineaire AZ-sequentie
Natief = biomoleculen hebben intacte structuur
2) Agarose gel elektroforese
- Scheiding van nucleïnezuren op een agarose gel
- Voorbereiden opstelling
o Gieten van agarose gel
Agarose poeder + buffer → opwarmen zodat agarose smelt
Buffer = TAE of TBE → tris-acetaat-EDTA of tris-boor-EDTA
EDTA = bindt divalente kationen (Ca2+, Mg2+) want bv Mg wordt
gebruikt door enzymen die DNA en RNA afbreken
→ door EDTA toe te voegen stabiliseer je DNA en RNA
Laten afkoelen in gelbakje met kam
o Staalvoorbereiding
Laadbuffer toevoegen aan je DNA/RNA staal
Kleurstoffen: zien hoe ver je staal migreert, maar bindt niet met DNA/RNA
zelf → broomfenolblauw of xyleencyanol
Glycerol toevoegen: staal zwaarder maken zodat het staal in de gel blijft en
niet naar boven drijft in het water dat boven de gel wordt toegevoegd
o Gel laten lopen
DNA stalen in “welletjes”
deponeren
, DNA ladder/ marker toevoegen = mengsel van DNA fragmenten met gekende
lengte → referentiewaarden
o Visualiseren via bindende kleurstoffen
Bij DNA/RNA binding geven bepaalde kleurstoffen een fluorescent signaal
onder UV of blauw licht
Ethidiumbromide (EtBr):
Signaal bij UV licht → ogen en huid beschermen + DNA beschadigt
Zeer gevoelig (1-5 ng (nanogram))
Toxisch en mutageen/ carcinogeen
SYBRsafe:
Blauw licht en UV licht
Zeer gevoelig (1-5 ng)
Minder mutageen, maar nog steeds toxisch
- Toepassingen:
o Lengte DNA fragment nakijken
o Scheiden van DNA fragmenten voor opzuiveren
DNA fragmenten liggen door elektroforese verder uit elkaar → isoleren van 1
fragment door dit uit de gel te snijden
DNA uit gelblokje isoleren/ zuiveren
o Nakijken integriteit RNA:
RNA → veel rRNA → coderen voor 2 subeenheden ribosomen dus gaan 2
grote signalen uitzenden
2 duidelijke ringen: RNA is intact
Signaal is uitgesmeerd: RNA is gedegradeerd = afgebroken door RNase
- Gelpercentage bepaalt de poriegrootte van gelmatrix !!
→ hoe lager percentage, hoe groter de poriën, hoe verder DNA fragmenten kunnen migreren
→ je moet dus een percentage kiezen dat compatibel is met de DNA fragmenten die je wilt
analyseren!!
3) Polyacrylamide gel elektroforese (PAGE)
- SDS-PAGE → scheiding volgens massa/grootte
o SDS = sodium dodecyl sulfaat = anionisch detergent
o Principe: denaturerende werking
SDS toevoegen → bindt met aan aminozuren van eiwit → ontvouwt eiwit en
geeft een uniforme negatieve lading
2-mercaptoethanol → disulfidebruggen breken
Opwarmen tot 70°C → eiwit wordt beweeglijker en gaat makkelijke
ontvouwen (niet hoger als 70°C → samenklitten)
o Lineaire structuur met negatieve lading (proportioneel aan lengte & massa eiwit)
op/in de gel laden
o Negatieve pool aan kant van staal → elektrisch afstotend → migratie richting
positieve pool = elektrisch aantrekkend
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur laurebrants. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €4,89. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
