Summary of the course: Genome Technology and Applications (19/20): This summary contains notes taken during the lectures/seminares and all information needed to pass the exam of 'Genome Technology and Applications' given in the first Master year of Biomedical Sciences. This includes all information...
G&G – LES 1: Cell-based DNA cloning
Intro:
New cloning methods self study maar er is een feedback session hierover in een lecture waar
er oefeningen gemaakt worden.
Seminar:
- Preparation: topic in groep (10 min presentatie) + discussie
- Meest recente technieken NGS (belang techniek in genomics)
Knowledge: genetica en moleculaire biologie
Terminologie!
1. Principe van DNA cloning
Hierbij clone je in cells (bv PCR of andere gerelateerde technieken= in vitro cloning) in vitro =
in glass. Cloning = waarbij je amplified nucleic acids
Dus cloning in a bacterium and multiply the DNA with the PCR (= amplify the DNA tube
while not amplify it in a cell, not every DNA will undergo this cell-based DNA that is still
used).
Cell based DNA cloning bestaat uit 4 stappen:
1) In vitro construction of a recombinant DNA molecule: eerst construct je DNA
moleculen (copy and paste)
2) Transformation = put it in a host cell grow host cell multiply
3) Selective propagation of clones: selectieve (door een selectable marker, zodat host
enkel propagate als het de recombinante molecule bevat) propagation of clones
4) Isolation of recombinant DNA clones: einde procedure: isoleren van recombined
DNA clones
4 stappen niet altijd aanwezig, soms wil je alleen de recombinante molecule in de cel
plaatsen en de properties van de cel bestuderen, dus niet alle stappen zijn altijd nodig maar
de 4 stappen zijn algemene principe.
Stappen
1) In vitro construction of a recombinant DNA molecule
Dit wordt altijd uitgevoerd in vitro (dus in testtubes). cutting en pasting nodig van DNA.
Hiervoor hebben we een toolbox: de restrictie endonucleases, dit zij enzymes om DNA te
knippen. We hebben ook DNA ligase nodig om het aan elkaar te plakken. Het heeft ook een
replicon nodig (een replicon is een stuk DNA, die onafhankelijke DNA replicatie mogelijk
maakt) dus wanneer je je recombinante DNa molecule in de host doet, moet het in de host
aanwezig zijn en ook in de host blijven. Je gebruikt hiervoor meestal een vector, dit is een
stuk DNA die het replicon bevat en dit maakt het cloning proces makelijker. DNA replicatie
betekent dat meestal een ORI nodig ( = origin of replication) dit is een DNA sequentie die
een polymerase laat werken om meer DNA te maken. Dus als de cel divides dan zal er ook
meer DNA van recombinante DNA molecule aangemaakt worden dat doorgegeven wordt
aan de dochtercellen. Dit is niet bij alle stappen nodig, als je dat niet hebt en je doet gewoon
een stuk DNA erin dan kan je natuurlijk ook dingen zien gebeuren zo kan je bv expressie zien
(als je een promotor en een gen erin doet dan kan het deze expresseren). Dus het zal dividen
maar niet repliceren en zal kwijt geraken dus je krijgt enkel expressie als de cellen niet
dividen bv een paar dagen en dan zal het declinen, dit wordt ook cloning genoemd ookal lijkt
,het niet echt cloning bv in expressie studies. Maar meestal wil je een replicon en wil je dat je
cellen dividen met je recombinante DNA molecule ook dividen en aanwezig zijn in de cel.
Wat vaak gebruikt wordt in cloning zijn plasmides = klassieke approach.
Plasmides zijn circulaire DNA moleculen die aanwezig zijn in bacterien. Je kan ze als vector
gebruiken en openen met restricitie enzymen en dan kan je het daarna terug plakken in een
recombinante DNA molecule. Dus eig neem je een stuk van bact DNA = plasmide en een stuk
humaan DNA en deze plak je in een hybride molecule.
- Dus cutting en pasting van DNA nodig
o Restrictie endonucleases
o DNA ligase
- Requires a replicon
o A piece of DNA that makes independent DNA replication possible
o Replicon is specific for a host
o Usually a construct called ‘vector’ is used, containing many features used in the
cloning process.
2) Transformation en de recombinante molecule (van stap 1) in een host cell introduceren
Meestal is het een bacterium of een yeast maar het kan ook eukaryote cel zijn of een
humane cellijn, er zijn veel mogelijkheden. Maar een bacterium en yeast zijn favoriet
omdat ze makkellijk en snel groeien zijn en een snelle reproductie hebben.
Eukaryote cellen worden ook vaak gebruikt vooral voor expressie studies. Vooral voor
de expressie van humane proteinen worden eukaryote cellen gebruikt, aangezien
bacteriele proteinen humane proteinen niet graag hebben omdat ze groot zijn of terwijl
bact proteine klaar zijn dus dan zullen bacterien proteinen humane proteinen niet graag
expresseren of als ze ze toch expresseren zullen ze ze niet juist vouwen en ze in inclusie
bodies steken (wat een manier is van de bacterie om te zeggen dat ze de humane
proteinen niet graag hebben en er van af willen en zal de proteine niet werken dus dan
kan je eukaryote cellen gebruiken. Er zijn bv insecten cellen (= eukaryote) dan gaat
cloning veel beter. Maar als je expressie studies (dus clonen in je eukaryote cellen): in
, bijna alle cases begin je toch bij bacterien om je construct met insertie te maken = je
vector. Eerst doe je het in bacterie en als je klaar bent DAN pas doe je het in eukaryote
cel voor expressie studies bv in de humane cellen. Cloning in bacterien wordt veel
gedaan en is standaard in bv E.coli. Transformatie is makkelijk: je neemt je
recombinante DNA molecule, je mixt het met de host cell en doet het in de host cell.
- Recombinant DNA molecule is introduced in a host cell
- Usually bacterium or yeast
o Easy to grown
o Fast production
- For expression studies, cloning is often done in eukaryotic cells (mammalian cells, insect
cells)
- For expression studies, cloning in a bacterium usually precedes cloning in the host used
for the expression
-
3) Selective propagation of clones
Cells are plated on agar
Each individual cell forms a colony
Each colony is a clone:
All cells are identical, and have the same ancestor cell
1 colony can be grown in liquid medium to obtain more cells
Na transformatie worden de cellen geplaatst op agar. Elke individuele cel vormt een kolonie
(petri dish met bodem van agar, wat suiker is en bevat nutrienten en je kan je bacterien erop
doen en dan groeien ze en vormen ze kolonies. Meestal bevat je vector een AB resistentie
gen en je voegt de antibiotic aan de agar plaat, dus alleen de cellen die de recombinante
DNA hebben opgenomen zullen groeien. Zo krijg je verschillende kolonies. 1 kolonie bevat
duizenden bacterien en ze zijn allemaal identiek.
Petri met limiterende aantal kolonies dus kunne groot worden rechts. Links: duizenden
kolonies die kleiner zijn omdat ze niet de mogelijkheid hebben om te groeien anders raken
ze de andere kolonies. Elk van deze kolonies origneert van 1 bacterium en in een kolonie zijn
alle clowns identiek, dus ze bevatten allemaal identieke DNA!
, 4) Isolation of recombinant DNA clones
The recombinant DNA is purified from the cells. Als je je construct wilt isoleren, om er meer
van te maken, bv als je het in je eukaryote cellen wil expresseren om het te bestuderen dan
moet je lys de bacterien en de plasmide purify. Dit is makkelijk doordat plasmides hebben
speicifieke karakteristieken om ze te isoleren van het bacteriele genoom DNA dan veel
groter is.
2. Restriction nucleases
Nomenclature: 1 letter genus, 2 letters species, followed by number E.g. HaeIII: Hemophilus
aegypticus
Defence mechanism against bacteriophages
- DNA from bacteriophage enters the bacterium and is cleaved
- There is a matching sequence specific DNA methylase
o Methylation of the same recognition sequence
o Bacterial DNA cannot be cut
- Type II RE will cut a specific recognition sequence
- Usually 4-8 bp
- Usually palindrome
- Ze hebben allemaal namen: Hae 3, het is een 3e restrictie enzym dat ze in de Hemophilus
aegypticus species van bacterien hebben gevonden
- REN: zijn defense mechanismen tegen virussen die bact infecteren = bacteriophages. Er
is een cte battle tussen bact en virussen en virussen proberen bact te infecteren en bact
proberen hun eigen te verdedigen tegen virussen. Een manier om hun zelf te
beschermen is via REN. Als een bact een REN heeft, dan als de bactereriofaag zijn DNA in
de bacterium injecteert, dan zal het geknipt worden door de REN maar bact moet
oppassen dat het niet zijn eigen DNA geknipt wordt. Maar hiervoor heeft een REN altijd
een matching methylase. dEze methylatie zal van dezelfde herkenningsite zijn, dus REN
heben speicifieke recognition site, ze herkennen specifiek een DNA sequentie en enkel
daar wordt er geknipt en in de bact zal elke sequentie gemethyleerd worden en de REN
is zo geeingenieerd door de bact zodat als het gemethyleerd wordt het niet zal knippen.
Dus de bact produceert de REN in zijn cel en het zal elke DNA knippen met die sequentie
maar het methyleert dus zijn eigen sequenties dus alles wordt gemethyleerd niks wordt
geknipt maar als een virus binnenkomt wordt het DNA van de virus direct geknipt en dan
wordt het virus gedeact en kan het niet de bact doden = defense mechanism van
bacterie tegen bacteriofaag. Zo beseften mensen dat deze techniek gebruikt kan worden
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur lemmeslodders. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €7,39. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
