Resume
Summary OPLOSSING EXAMENVRAGEN Pharmaceutical Medicine
- Établissement
- Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Antwoorden op de mogelijke examenvragen die vooraf gegeven worden.
[Montrer plus]
2 revues
Par: VVD • 5 mois de cela
Par: anvanmaercke • 4 mois de cela
Aperçu du contenu
1. Bespreek de sterkten en zwakten van de twee verschillende wijzen voor de ontdekking vangeneesmiddelen. Geef ook enkele voorbeelden.
1) Phenotypic Drug Discovery
= empirische, holistische methode gebaseerd op observationele karakteristieken (read-outs) van een
organisme (cel of dier). Holistisch wil zeggen dat je de focus legt op een organisme of cel in zijn
geheel en niet op een specifiek target.
Voordelen:
- ‘Target unbiased’ = Geen kennis nodig over patho-mechanische details
- Vergroot kans op firs-in-class GM (GM met nieuw & uniek mechanism of action)
- ADME van compound wordt indirect getest
Nadelen:
- Er is geen target bij betrokken dus er is ook geen kennis over het target dit maakt het moeilijk
om de structuur te optimaliseren
- Hele aanpak is low throughput, je kan slechts een aantal cellen testen maar zeker geen 1000.
Voorbeelden:
- In vitro antiproliferation assay (cells)
o Gebaseerd op het feit dat tumorcellen zouden prolifereren op een ongecontroleerde
manier, dus onderzoekers isoleren tumorcellen van tumorbiopsies. De tumorcellen
prolifereren in een 96-well plaat. De cellen kunnen exposed worden aan compounds, in
hoeverre inhiberen deze compounds de proliferatie? De cellen zijn ook metabolisch actief
waardoor ze blootgesteld kunnen worden aan een kleurloze compound, maar omgezet
worden in een gekleurde compound (stain). Je kan de stain extraheren: hoe meer
compound gebruikt werd, hoe minder proliferatie, hoe zwakker het ontwikkelde kleur.
- In vivo antitumoral assay (animal)
o Gebruik van dieren = kosten stijgen dramatisch!
o Je start met een in vitro assay om een tumor cellijn te selecteren die gevoelig is aan het
compound, dan injecteer je die tumorcellen onder de huid van een naakte muis (deze zijn
immuun deficiënt). Onder de huid zie je de tumorcellen die prolifereren je ziet een bult
verschijnen onder de huid. Met een kaliber kun je de groei van de tumor in functie van de
tijd volgen. De groei zal niet zo snel zijn als het compound dagelijks wordt gegeven.
o Ook het lichaamsgewicht van de muizen worden opgevolgd om te zien of het compound
niet toxisch is.
2) Target-based Drug Discovery
= rationale, moleculaire methode gebaseerd op kennis van het patho-mechanisme. Deze kennis komt
van fundamentele biomedische research (vaak academisch). Universitairen van over de hele wereld
publiceren veel zodat data publiek beschikbaar wordt, van deze data kan een target/doelwit
gedefinieerd worden.
Voordelen:
- High throughput mogelijk
- monoclonale Ab aanpak mogelijk.
- Deze methode is rationeel omdat je het target kent, je hebt er achtergrondinformatie van.
(intellectueel aantrekkelijk)
Nadelen:
- Is het target gevalideerd en relevant in een grotere context?
Voorbeelden:
- In vitro kinase assay (enzyme)
o Biochemische assay, ELISA procedure: synthetisch peptide op 96-well plaat plaatsen,
kinase enzyme + ATP toevoegen. Peptide zal gefosforyleerd worden door het kinase (dit
zie je niet). Later ga je iets toevoegen voor visualisatie: Ab die gefosforyleerde peptide
herkent, aan Ab is een enzyme gelinked: HRP (horse radisch peroxidase) dit enzyme zal
een compound (TMB reagent) omzetten in een kleurrijke compound. Hoe meer P-peptide,
hoe intenser het kleur.
- In silico drug design (PC)
o Design/ontwerp door computationele methode: het is mogelijk om onder specifieke
omstandigheden een specifiek proteïne te kristalliseren. Indien deze kristallen
geanalyseerd worden door een X ray diffractie methode kan je gedetailleerde structurele
informatie over de conformatie van het proteïne verkrijgen. Je kan ook een inhibitor co-
kristalliseren samen met een proteïne zodat je je molecule van interesse kan ontwerpen.
,2. Discuss 2 target deconvolution strategies in drug discovery. – Bespreek 2 target identificatie
strategieën in de ontdekking van geneesmiddelen.
1) Affiniteit chromatography-based methods
Ligand = compound (small molecule) & Target = groot molecule of proteïne
Affiniteit = een ligand of compound of interest toont affiniteit voor een target en bindt op/in een specifiek
deel van het target = fysical interaction (hoeft niet per se covalent te zijn). De optimale waarde voor de
dissociatieconstante ligt tussen 10-7 en 10-15 met Kd = [L][P]/[LP]. Er wordt dus zo een complex gevormd,
hoe meer complexen gevormd, hoe meer affiniteit het ligand voor het target toont of omgekeerd. Deze
situatie is een evenwicht: L + P LP en de concentratie van het ligand kan gecalculeerd worden.
Zoeken naar een target in een mengsel: optimale situatie is waar de proteïne aanwezig is in hoge
concentratie (makkelijker om target te vinden). Maar hoge concentratie kan binding verduisteren van
eiwitten die in lagere concentratie aanwezig zijn. Want eiwit kan aan hoofdeiwit binden maar ook aan laag
abundante eiwitten. Dit maakt het moeilijker om het target van interesse te vinden als er veel targets zijn
door lage abundantie. Een chemische modificatie met een linker (binding aan carrier) kan drug inactiveren.
Werking:
- Kolom met compound waarvan je target wil vinden covalent op gebonden = immobilisatie stap
- Cel homogenaat met alle proteïnen in wordt over kolom geladen = loading step
- Kolom wassen: Proteïnen die geen affiniteit voor compound tonen worden weggewassen. De
moleculen die overblijven zijn gebonden aan compound en zijn dus onze targets of interest.
- Eluatie: pH veranderen zodat affiniteit veranderd wordt en targets loskomen.
- Verkregen fracties op SDS-page plaatsen bandje uitknippen, proteasen toevoegen (zodat je
peptides verkrijgt) in liquid chromatography mass detection systeem injecteren om massas te
identificeren.
- Nadeel: moeilijk om na SDS-page te weten welk bandje het target bevat (want ook andere proteïnen
zullen binden aan compound = meerdere bandjes zichtbaar op SDS-page).
o Oplossing:
inactief ligand immobiliseren op bead.
Structureel analoog aan compound maar is inactief dus zal niet binden met target
maar kan wel nog met andere proteinen binden
Excess amount of ligand die niet gebonden is aan bead toevoegen)
bindt met andere proteinen die aan ligand binden maar zo kunnen die proteinen niet
aan ligand binden die wél aan bead hangt
2) Expression-cloning-based methods
Ook gebaseerd op affiniteit, maar gebruik gemaakt van een celsysteem.
Voordeel: geen low target protein abundance cellen die je gebruikt zullen alle mogelijke proteïnen in
dezelfde hoeveelheid bevatten.
Nadeel: als je bv gistcellen gebruikt = geen of verschillende post-translationele modificaties van target, wat
kan leiden tot een andere proteine-folding (target is dus niet hetzelfde als in zoogdiercellen)
Oplossing: zoogdiercellen gebruiken (maar duurder)
Three-hybrid system:
1) Part 1 – fusion protein (expressed in all cells)
Fusion = bestaat uit 2 verschillende proteinen maar wordt tot
expressie gebracht als 1.
DNA-binding domein fusie met DHFR gebonden aan binding
site van reporter gen. DHFR heeft een hoge affiniteit voor MTX
(methotrexaat). Alle cellen moeten getransfecteerd worden met
gen die dit fusieproteine tot expressie zal brengen!
2) Part 2 – linker system (small molecule linked to MTX)
Linker gekoppeld aan MTX + small molecule (dextrane of PEG)
MTX= antitumoraal en heeft als target DHFR, MTX inhibeert
DHFR.
MTX zorgt er dus voor dat oranje molecule (small molecule) zijn
weg vindt naar het DNA.
3) Part 3 – fusion protein (expressed in individual cells)
Ander fusieproteine: transcriptional activation domain (die B-
galactosidase gen tot expressie brengt) + potential target (komt
van complementaire DNA library). Het idee is dat elke cel
aanwezig een specifiek proteine van de library die gelinked is aan
het activation domain tot expressie zal brengen. De ideale situatie is dat er 1 target proteine tot expressie wordt
gebracht. Als library proteine (lichtgroene molecule) target is van small molecule (oranje) zullen ze interageren. Zo
komt het activation domain dicht bij het DNA waar ook een reporter gen zit. Reporter gen (B-galactosidase) wordt
tot expressie gebracht cellen blootstellen aan X-gal (kleurloos): blauwe kleur verkregen.
,3. Geef een overzicht van de fysicochemische en biofarmaceutische aspecten die bestudeerd worden
tijdens de preformulatie fase als deel van de “farmaceutische profilering” van een API.
1) Oplosbaarheid
= belangrijkste fysicochemische eigenschap!
Bepaalt:
Selectie doseringsvrom
Toxicologische studies, farmacokinetiek, farmacologische studies
Orale biobeschikbaarheid wordt bepaald door oplosbaarheid in de GI-vloeistoffen
o Biofarmaceutisch klassificatiesysteem (BCS):
o Wordt bepaald door temperatuur water, pH, buffers, ionische sterkte, biorelevante media
(FASSIF, FESSIF)
o FASSIF = fasted state stimulated intestinal fluid
o FESSIF = fed state stimulated intestinal fluid
o Producten die oplosbaarheid kunnen verhogen:
o Cosolventen: PG (propylene glycol), PEG (polyethylene glycol), glycerol zullen
polariteit verminderen
o Complexing agents vormen complexen
o Surfactanten, polymeren
o Oplosbaarheid meten via high throughput set up (HPLC)
2) Dissolutiesnelheid
= snelheid waarmee een compound oplost snelheid waarbij een bepaalde [API] kan worden
verkregen.
Belangrijk voor orale biobeschikbaarheid (indien compound niet oplost = API niet opgenomen)
o Nernst-Brunner vergelijking:
o = hoeveel massa kan oplossen ifv de tijd
o Lage dissulotiesnelheid = niet alles zal opgenomen zijn
3) Ionisatiegedrag
= bepaling van pKa & pKb via potentiometrische titratie, UV spectroscopie en in silico
Veranderen van pH van oplossing om oplosbaarheid van API te verhogen/verlagen
Als we het ionisatiegedrag van compound kennen kunnen we nagaan of het vormen van zouten
de oplosbaarheid kan verbeteren!
= maken van zouten als strategie om compounds met lage oplosbaarheid beter te laten
oplossen.
Geladen vorm compounds => verhoogt oplosbaarheid!
Ionisatiegedrag in vivo absorptie, biobeschikbaarheid
4) Partitiecoëfficiënt / distributiecoëfficiënt
= log P / log D pH afhankelijk!
- Indicatie van lipofiliciteit / hydrofobiciteit
- Indicatie van in vivo absorptie (passieve diffusie)
- N-octanol vaak als solvent gekozen komt meest overeen met lipofiliteit van membraan => gaat
log P & D bepalen
, 5) Vaste stof eigenschappen van API
Is het API kristallijn of amorf (glas)?
Kristallijn Amorf
- Moleculen zijn in 3D gerangschikt in een - Chaotische ordening van moleculen (zoals in
specifiek patroon (kristalrooster) afstand tussen vloeibare fase)
individuele moleculen is altijd hetzelfde - Geen smeltovergang maar een glas overgang (=
- Smeltpunt overgang van lage moleculaire mobiliteit naar hoge
- Thermodynamisch stabiel mobiliteit)
- Thermodynamisch onstabiel
= preferentiële vorm want meest stabiel - Hogere chemische reactiviteit
- Hogere oplosbaarheid en dissolutiesnelheid
Indien problemen met oplosbaarheid => werken
met amorfe API
o Moleculen kunnen ruimtelijk geordend worden op verschillende manieren om een rooster te
vormen = POLYMORFISME
I. Conformationeel polymorfisme
= verschillende confomaties van molecule, kunnen roteren
II. Configurationeel / stacking polymorfisme
= zelfde conformaties van molecule, maar stacken (stapelen) verschillend in de ruimte
Verschillende waterstof verbindingen => verschillende configuraties
De verschillende polymorfe modificaties hebben een verschillende stabiliteit, smeltpunt,
oplosbaarheid, oplossnelheid, …
Maar hun eigenschappen in de vloeibare en gasvormige toestand zijn hetzelfde
Invloed op biobeschikbaarheid, verwerkbaarheid
Ontwikkeling van de meest stabiele vorm!
Hoogste smeltpunt maar laagste oplosbaarheid
o Solvent moleculen kunnen geïncorporeerd zijn in het kristalrooster =
PSEUDOPOLYMORFISME
Intermoleculaire interacties tussen API en solvent bepalen sterkte van verbinding
De verschillende pseudopolymorfe modificaties hebben ook een verschillende stabiliteit,
smeltpunt, oplosbaarheid, oplossnelheid, … maar hun eigenschappen in de vloeibare en
gasvormige toestand zijn hetzelfde.
6) Chemische stabiliteit van API
- Stabiliteit van vaste fase
o Invloed van warmte, licht, water (hydrolysis)
- Stabiliteit in oplossing
o Invloed van warmte, licht, zuur, base, oxiderende omgeving
- Compatibiliteit met hulpstoffen en verpakkingsmaterialen: nagaan of die wijzigingen aanbrengen
aan API
7) Permeabiliteit / absorptie potentieel
API moet geabsorbeerd worden in het systeem om actief
te kunnen zijn
Verschillende methodes beschikbaar om dit te testen:
- Parallel artificial membrane permeation assay
(PAMPA)
o Lipidenlaag tussen acceptor- en donorvloeistof
o Hydrofiel: lage passage door membraan
o Hydrofoob / lipofiel: hogere passage
o Voordelen Nadelen
Geen dieren nodig Enkel partieel voorspelbaar (passieve diff)
High throughput, veel exp tegelijk Lipofiele compounds tegengehouden
Niet zo duur Performance afhankelijk van lipide
Verschillende membraan composities compositie en pH
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur academic88weapon. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €12,99. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
Peut-on faire confiance à Stuvia ?
4.6 étoiles sur Google & Trustpilot (+1000 avis)
81113 résumés ont été vendus ces 30 derniers jours
Fondée en 2010, la référence pour acheter des résumés depuis déjà 14 ans
