Methoden
3.2. DNA
3.2.1 DNA sequentiebepaling
Evolutie in methoden
First-generation sequencing (1977)
Sanger, (Maxam and Gilbert)
cloneren (plasmiden - bacteriën)
elektroforese
nog steeds “gouden standaard”, voor kleine projecten
Second-generation sequencing
‘next-generation sequencing’ (2006-…)
massief parallel sequencen van clonaal in vitro
geamplificeerde DNA moleculen
bv. Illumina, Ion Torrent
Third-generation sequencing
“next-next generation sequencing” (2010-…)
sequencing van individuele DNA moleculen
(geen amplificatie)
bv. Nanopore, Pacific Biosciences
Brede toepassingen
De novo genoom sequentiebepaling
ongekende genomen-> voor eerste keer sequencen
bv Humaan Genoom project
nieuwe organismen (bv. Sars-CoV-2)
gedeeltelijk of volledig
Resequencing
individuen tov referentiegenoom
verschillen tussen individuen (SNPs)
mutaties (ziekten)
Construct verificatie
klinische toepassingen:
diagnose, farmacogenetica, NIPT
(niet invasieve prenatale test), …
Sequentiebepaling als teller
, aantallen DNA (of RNA) moleculen
(zie RNAseq, ChIPseq,…)
3.2.1.1 1ste generatie sequentiebepaling
Twee methoden: Maxam en Gilbert / Sanger (1977, Nobel prijs 1980)
Maxam en Gilbert = chemische klieving methode (historisch, ter
illustratie)
Fosfaat groep vervangen door radioactieve fosfaat
1 van de 2 labels verwijderen met restrictie enzymen
differentiële chemische klieving van nucleïnezuren in 4
verschillende reacties, gevolgd door scheiding volgens grootte op
gel en visualisatie via autoradiografie->-> bv 1 ste buisje->
breken na de eerste G, bij de tweede na een A of een G
nadeel: relatief korte fragmenten, niet helemaal specifiek
sequentie niet altijd éénduidig
Sanger sequencing = nieuwsynthese met dideoxy-keten terminatie
template/matrijs = clone of PCR amplicon bv van genomisch DNA-fragment
polymerase + primer + mengsel van 4 dNTPs + ddNTPs(Normale dNTP: 2’OH groep ontbreekt,
bij ddNTP: ook 3’ OH groep ontbreekt, dat is de OH groep die fosfodiesterverbindingen gaat
vormen in een DNA keten
reactie loopt door na inbouwen dNTP
reactie (keten) stopt na inbouwen ddNTP
juiste verhouding dNTPs/ddNTPs
scheiding strengen op gel of capillair -> elektroferogram-> Capillaire gelektroforese: kleine
fragmentjes (paars) komen eerst voorbij de sensor en worden eerst afgelezen, langste
fragmentjes laatst, dus van links naar rechts is van klein naar groot.
beperkt tot ~500 nt, moeite met herhalingen
voor betrouwbaarheid: best twee aparte reacties
(FW of RV primer) om beide richtingen af te lezen
Elektroferogram aflezen
1ste 30 bp niet afleesbaar
meestal 500-700 bp (max. tot 1000 bp) goede
sequentie afleesbaar
Phred score Q = -10*log10(P)
P = probabiliteit van foutieve base cal
-> Score van 10-> 1 op de 10 basen zijn fout
Minimaal een score van 20 voor een goede maar liefst 30
,Mutatiedetectie
Sanger sequencing gebruikt voor mutatiedetectie
Niet altijd even hoge pieken
sequentie-fout versus mutatie? -> forward en reverse
reacties ter bevestiging
3.2.1.2. 2de generatie sequentiebepaling: short-read next-
generation sequencing
doel: veel hogere throughput aan veel lagere kost massale DNA sequentiebepaling mogelijk
richtdoel: 1 humaan genoom op 1 toestel per dag voor <1000 USD (“thousand-dollar
genome”)
Ontwikkeling van nieuwe technologie met 3 pijlers:
parallelle detectie (Massive parallel sequencing)
cluster of polony = kopieën van een DNA template
klonale in vitro amplificatie van template (<> klassieke klonering)
duizenden-miljoenen kopieën van DNA template per cluster
multiplexing: vele clusters tegelijk (<> 1 template/reactie)
miniaturisatie van reacties
integratie van het proces (pipeline)
directe detectie (<> scheiding fragmenten via gelelectroforese)
Verschillende commerciële platformen
454/Roche, Illumina, SOLID, Ion Torrent,..
Zeer competitief
Snelle evolutie
Gebaseerd op 4 stappen:
Stap1. Aanmaak DNA library
Stap 2. Klonale in vitro amplificatie
Stap 3. Sequencing/sequentiebepaling
Stap 4. Data analyse
, Stap 1: aanmaak NGS(: next generation sequencing) DNA library
library = fragmentenbank = verzameling te sequencen templates
types DNA library:
whole genome sequencing (WGS)
Mate Pair libraries (zie verder)
whole exome sequencing (WES) of targeted sequencing:
aanrijking door hybridisatie aan probes (in oplossing of op array) (zie panel A) of PCR-
gebaseerd (zie panel B)
amplicon sequencing: PCR amplicons, bv. diagnostisch panel
cDNA library (RNA-seq – Zie Hfst RNA)
A:
Alle exons als oligos hybridiseren op het
plaatje, introns worden weg gewassen
Kan ook met beads gedaan worden
B:
PCR amplicons maken: PCR primers
maken tegen alle exons sequentie en
dan amplificeren we de exons
-> kan bij mondeling examen komen: hoe exon
sequentie doen?
Procedure voor aanmaak library:
input DNA -> kwaliteitscontrole (zie Hfdst 1.13)
hoeveelheid en concentratie: verschillende methoden
zuiverheid, bv spectrofotometrie A260/280 en A260/230
ratio
integriteit, bv capillaire elektroforese
random fragmentatie (sonicatie, nebulisatie, Dnase I,…)
vinden we altijd een overlap
end repair (zie ook Hfdst 1.13)
blunt ends maken (T4 DNA polymerase en Klenow
fragment)
5’ uiteinde fosforyleren (T4 polynucleotide kinase)
eventueel 3’ non-template A aanhechten (Taq
polymerase)
adapters aanhechten:
