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samenvatting gel elektroforese
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samenvatting gel elektroforese
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1. Gel elektroforese Scheiding van moleculen (DNA, RNA, EW) op basis van grootte
Scheiding gedreven door de negatieve lading van moleculen
Fosfaatgroep (-)
Suiker
Base
O.i.v elektrisch veld bewegen moleculen richting pos pool door een gel
= kathode (+) naar anode (-) (KNAP)
1.1. Eiwitten
Eiwitscheiding m.B.v verticale elektroforese
Gel = polyacrylamide
Coomassie blauw bindt niet – specifiek aan = EW
1.2. DNA
DNA gescheiden m.B.v horizontale elektroforese
Gel = agarose
Nancy of redsafe (vroeger ethidium bromide) of Diamond bindt specifiek aan DNA
voor visualisatie
DNA in slots
Elektrisch veld
Migratie neg geladen DNA naar pos pool
Visualisatie m.B.v fluorescente dye die bindt aan dsDNA en fluorisceert onder UV licht
Stappenplan: methode en principe
Aanmaak buffer
Aanmaak agarose gel
Laden gel
Elektroforese
DNA visualisatie
1.2.1. Aanmaak buffer
TBE of TAE (2 – voddige beschermende functie voor DNA molecule)
Trips = base Bufferwerking, licht alkalisch -> beschermt DNA
Boorzuur of acetaat = zuur Tegen hydrolyse.
EDTA blokkeert werking van DNase
1.2.2. Aanmaak agarose gel
1
, Agarose = extract van zeewier (vergelijkbaar met gelatine)
Moleculaire zeef
Kleinere molecule bewegen sneller dan grotere moleculen
Grootte DNA molecule uitgedrukt in bp
Agarose poeder vermengen met buffer en opwarmen tot kookpunt
Percentage gel kan aangetast worden
- Vb: 1% agarose gel = 1 g agar/100 ml buffer
Keuze percentage gel hangt af van grootte te scheiden fragmenten
- Kleine frag = hoger percentage gel
- Grote frag = lage percentage gel
Na opwarmen tot kookpunt van mengsel agarose en buffer
Toevoegen fluorescente kleurstof
- Nancy
- Redsafe
- Diamond
- Vroeger ethidium -> zeer toxisch
Na opwarming tot kookpunt van mengsel agarose en buffer
Toevoegen fluoricente kleurstof
Laten afkoelen tot handwarm
Uitgieten in mal = gietvorm/matrijs
Toevoegen slotkam -> slotje vormen
Laten stollen/uitharden
Kammetje verwijderen
1.2.3. Laden van de gel
Pipetteren van DNA oplossing in slotje van de gel
Gel in elektroforese toestel + TBE buffer (onderdompelen)
DNA mengen met loading dye (= laadbuffer)
- Kleurstof: opvolgen pipetteren en elektroforese
- Glycerol: densiteit verhogen zodat DNA oplossing in slotje zakt
- EDTA: beschermen DNA tegen nucleases
Hoe frag grootte bepalen na scheiding van frag?
Pipetteer in 1e laantje DNA ladder = moleculaire merker
Mengsel DNA fragmenten van gekende lengte worden meegelopen tijden
selektroforese
- = referentie waarmee te onderzoeken frag vergeleken kunnen worden
1.2.4. Elektroforese
2
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