Volledige samenvatting hoofdstuk 6 van methoden in het biomedisch onderzoek 3. Hoge punten al bewezen na gebruik van deze samenvatting, 16+/20!
de lessen van Dirk ontcijferd en verwerkt in zeer begrijpbare tekst.
,6. Analyse van gentranscriptie regulatie
DOEL & RELEVANTIE:
- Elke cel van een organisme bezit dezelfde genetische
informatie
- Regulatie van genexpressie bepaalt welke RNAs en
proteïnen gesynthetiseerd worden en hoeveel ervan
Basis voor cel differentiatie en respons op interne of
externe signalen.
- Regulatie van genexpressie gebeurt op verschillende
niveaus => zie afbeelding, dat bekijken we deze les
- Transcriptie regulatie in eukaryote cellen
6.1. Nascent RNA analyses
Nascent RNA = An RNA molecule in the process of being synthesized (hence incomplete) or a
complete, newly synthesized RNA molecule before any alterations have been made (e.g., prior to
nuclear processing or RNA editing, both of which see). – Oxfordreference.com
Meet transcriptie activiteit via kwantificatie van gelabelde nascent RNA moleculen (= ‘ontluikend’
RNA of nieuw afgeschreven RNA)
Directe meting van transcriptionele activiteit!
, 6.1.1. Run-on assays
Methoden om transcriptioneel actieve genen in kaart te brengen.
6.1.1.1. Basis Run-on assay
Cellen afkoelen, alle processen stoppen. Uit deze gekoelde cellen isoleren we de nuclei. Incuberen
met NTPs (bouwstenen van RNA dNTPs dat de bouwstenen van DNA zijn) en 32P-UTP, gemerkte
Uracil-base. Ook voegen we Sarkosyl toe, deze stof zal nieuwe TXN verhinderen van te starten. We
willen namelijk enkel de TXN meten die al bezig was. Na al dit toe te voegen verhogen we de
temperatuur weer tot 37°C zodat de TXN afgemaakt kan worden. Dan gaan we de nascent RNA
extraheren en deze hybridiseren op een membraan met geïmmobiliseerde DNA probes van de te
onderzoeken genen. We zijn dus beperkt door de DNA-probes die we op het membraan plaatsen van
op voorhand gekozen genen. Hiervan doen we dan een kwantificatie.
Directe mapping van actieve polymerases.
6.1.1.2. GRO-Seq
Global Run-on Sequencing
genoom brede mapping van transcriptioneel actieve genen
- Maken gebruik van gebromeerde (Br-UTP) ipv. radioactieve-UTP (basis run-on assay, 32P-UTP)
- Immunoprecipitatie van nascent RNA mbv. anti-BrdU antilichamen (BrdU = Br-UTP)
- Constructie van cDNA library en deep sequencing om nascent RNAs te identificeren en dan
ook genen identificeren!
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