Uitleg van moleculaire technieken van het vak Genoom Deel 2: van alle besproken DNA, RNA en eiwit-analyse technieken wordt de werking en de interpretatie van de resultaten van de techniek tot in detail besproken. De informatie uit hoorcolleges, werkcolleges, practica en Labstermodules zijn allemaal...
** Alle afbeeldingen uit deze weergave komen uit bronnen van het UMC Utrecht **
Week 7
HC Technieken: DNA, RNA
Bestuderen DNA, RNA, eiwit of een proces in de cel (= in levende omgeving): in vivo
Bestuderen DNA, RNA, eiwit of een proces uit de cel halen en bestuderen in een reageerbuis: in vitro
Basisprincipe in veel DNA/RNA-analysetechnieken is hybridisatie.
1. Denaturatie: dubbelstrengs enkelstrengs DNA of RNA
2. Renaturatie: enkelstrengs dubbelstrengs DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA
3. Gebruik van primer/probe/oligo: enkelstrengs DNA voor detectie van complementair gebied
a. 20 nt is uniek
DNA-analyse
PCR
Twee doelen:
1) Selecteren van een sequentie
2) Amplificeren van een sequentie
Proces:
Selecteren specifieke, dubbelstrengse sequentie en heel vaak amplificeren. Uit elkaar halen strengen door
hele hoge temperatuur. Daarna gebruik van 2 primers: forward en reverse primer, dezelfde sequentie maar
ene is in spiegelbeeld van 3’ naar 5’. Primers binden aan 3’ van target sequentie (3’ 5’): daarna m.b.v.
DNA-polymerase repliceren sequentie; de primer bevindt zich dus in de geamplificeerde sequentie. Na 1 e
paar cycli 2 dubbelstrengs DNA-moleculen die de sequentie bevatten, zijn geproduceerd. Uiteindelijk ook
productie van DNA-fragment van alleen specifieke sequentie, die daarna weer wordt geamplificeerd: zorgt
voor exponentiële toename.
PCR primers: complementair, specifiek en binden aan de grenzen van het DNA-fragment van interesse.
Benodigdheden voor PCR:
- Primers
- Nucleotiden
- DNA-polymerase
- DNA template
- Thermocycler: PCR machine
,Voorwaarden voor uitvoeren PCR:
- De uiteinden van het te vermeerderen stuk moeten bekend zijn
- Het stuk dat je wilt vermeerderen kan max. enkele duizenden bp groot zijn (tussen start en stop)
Restrictie-enzymen (endonucleases)
- Restrictie-enzym herkent sequentie in dsDNA
(dubbelstreng)
- Herkenning meestal via een symmetrische
sequentie
- Enzymen binden vaak als dimeer
o Verschil lineair en circulair DNA
Lineair DNA:
1x knippen = 2 fragmenten
2x knippen = 3 fragmenten
Circulair DNA:
1x knippen = 1 fragment
2x knippen = 2 fragmenten
- Door restrictie-enzymen kunnen er verschillende soorten uiteinden van de breuk ontstaan:
o Sticky 5’ end: overhang
o Sticky 3’ end: overhang (EcoRi, Hindlll)
o Blunt ends (Haelll): d.w.z. stomp, zowel het forward als reverse DNA-uiteinde zijn even lang
DNA-gelelectroforese
- Scheiding DNA-fragmenten op basis van grootte
o Gel werkt als een soort zeef/net
- Het patroon van DNA-fragmenten wordt de DNA-ladder genoemd
- Door een marker toe te voegen in 1 van de openingen, waar fragmenten van verschillende grootte
in zitten waarvan de grootte bekend is, creëer je een referentie: zo kun je de onbekende grootte van
de fragmenten afleiden door te kijken naar de plaats t.o.v. de marker in de gel
- Fragmenten migreren van – naar + pool
o DNA is negatief geladen
- Kleinste (in grootte) fragmenten migreren het snelste naar + pool
- DNA-fragmenten zijn net als gel bijna doorzichtig: DNA zichtbaar maken in gel m.b.v.:
o Ethiumbrome en UV-licht
o Radioactief 32P-gelabelde nucleotiden
o Fluorescent gelabelde nucleotiden
Radioactief en fluorescent labelen zie Sanger sequencing
Dideoxy (Sanger) sequencing
Begin met PCR-reactie: DNA-fragment amplificeren
Verdelen over 4 reageerbuisjes en aan elk van de buisjes kleine hoeveelheid van 1 soort ddNTP toevoegen:
ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP = dideoxy d.w.z. i.p.v. OH, H-groep
In reageerbuisje vindt polymerase plaats van nieuwe DNA-fragmenten: als bij de polymerisatie door DNA-
polymerase i.p.v. dATP, een ddATP wordt ingebouwd, stop de verlenging van de DNA-streng: er kunnen
geen nieuwe nucleotiden meer worden ingebouwd. Door middel van gelelectroforese worden de
verschillende lengten DNA-fragmenten die hierdoor ontstaan van elkaar gescheiden.
- Zichtbaar maken DNA-fragmenten in gel bij Dideoxy sequencing door fluorescentie of radioactiviteit
o Ieder ddNTP heeft een eigen fluorescerende kleur
- Verhouding dNTP/ddNTP is belangrijk
, RNA-analyse
DNA/RNA-analyse o.b.v. hybridisatie + fluorescentie
- FISH: fluorescentie-in-situ-hybridisatie
o Om locatie van DNA-sequenties op mitotische chromosomen zichtbaar te maken
- In-situ hybridisatie
o Om aanwezigheid van specifieke RNA’s in bepaalde weefsels zichtbaar te maken (bijv.
muizenhersenen)
cDNA maken
Met behulp van reverse transcriptase en poly-T-primer: alle mRNA’s omzetten in dubbelstrengs DNA
- Poly-T-primer: alleen mRNA’s hebben een poly-A-staart, binden A-staart met T-primer
- Functies poly-T-primer:
o Startpunt voor reverse transcriptase ( primer)
o Alleen dubbelstrengs maken mRNA’s: andere soorten RNA hebben geen poly-A-staart
(herkenning mRNA’s)
Welke cDNA’s dit oplevert, is dus afhankelijk van de aanwezige mRNA’s: dit is dus variabel per weefsel en
conditie (momentopname)
Kwantitatieve RT-PCR
RT: reverse transcriptase
Via PCR bepalen of een bepaald mRNA heel veel of juist heel weinig aanwezig was in de cel. Meten van
de fluorescentie tegen de tijd (aantal PCR-cycli en dus amplificatie van sequentie)
- Naarmate hoeveelheid dsDNA-fragmenten stijft, neemt de fluorescentie toe
- Hoe hoger de concentratie van een specifiek mRNA bij aanvang, hoe minder cycli er nodig zijn om
de maximale fluorescentie te bereiken
- Aantal benodigde cycli is een maat voor hoeveelheid mRNA
Efficiëntie van de technieken
Elk van deze analysetechnieken heeft zijn beperkingen: het doel is om de aanwezigheid van een sequentie,
de sequentie zelf, de hoeveelheid en de locatie van de sequentie te bepalen.
DNA:
1. PCR: aanwezigheid
2. Restrictie-enzymen: aanwezigheid
3. DNA-gelectroforese: aanwezigheid
4. Sanger sequencing (dideoxy): sequentie
5. Next generation sequencing (tijdens WC): sequentie
RNA:
1. (in-situ) hybridisatie: aanwezigheid, locatie
2. cDNA maken: aanwezigheid, sequentie (na sequencing)
3. Kwantitatieve RT-PCR: hoeveelheid
4. RNA-sequencing (RNAseq) (week 9): aanwezigheid/hoeveelheid/sequentie
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur michelleweesie. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €4,49. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
