Genexpressie
HOOFDSTUK 15 : Transcriptie
Het centrale dogma:
DNA → pre-mRNA → RNA processing → rijp mRNA → activatie en
oplading aminozuren adhv tRNA →initiatie → elongatie →
terminatie → polypeptide → opvouwing → werkzaam proteïne
Reversed transcriptase (bepaalde bacteriën)
Van RNA, DNA maken
Celkern:
▪ Transcriptie: goedkope versie van DNA gemaakt: mRNA
Cytoplasma:
▪ mRNA verlaat kernporie
▪ Gaat naar ribosoom in R.E.R. of los in het cytosol
▪ Translatie: mRNA wordt gedecodeerd
Transcriptie: (afschrijving)
RNA
▪ Ribose suiker
▪ Uracil thymine
▪ Meestal enkelstrengig, kunne basenparen voorkomen (als streng opvouwt en basepaart met zichzelf)
▪ Veel functies en soorten
mRNA wordt afgeschreven van DNA via transcriptie in de celkern (zowel bij eukaryoten en prokaryoten)
DNA veel te kostbaar dus mag celkern niet verlaten, beschermd
Eerste bewijs van mRNA in prokaryoten gevonden: E coli met RNA complementair aan faag-DNA
rRNA vormen belangrijk onderdeel van ribosomen
tRNA brengen aminozuren (AZ) aan tijdens eiwitsynthese
Veel RNA is ncRNA (niet-coderend): rRNA, tRNA, …..
De RNA-synthese op een DNA-template
▪ Synthese van 5’ → 3’, DNA-template afgelopen van 3’ → 5’ door RNA-polymerase
▪ 3’OH-uiteinde laatst aangehechte nucleotide bindplaats voor volgende nucleotide
▪ Nucleotiden-trifosfaten NTP bouwsteen voor inbouw in de RNA-molecule → 2 fosfaten afgesplitst
▪ Verschil met DNA-synthese
Uracil ipv thymine
Slechts één streng van DNA wordt afgeschreven = coderende streng = sense streng
Complementaire of antisense streng => 3’-5’ streng van het DNA, gietvorm voor het mRNA
Geen nood aan primer om te starten
Geen proofreading en geen nuclease activiteit
,Transcriptieproces in prokaryoten:
Initiatie (start van transcriptie)
▪ RNA-polymerase = (α2ββ’σ) = holo-enzym core-enzym (α2ββ’)
▪ RNA-polymerase herkent een sequentie om te starten: de promotor (asymmetrisch) → bepaald richting
Constitutieve promotor : RNA-polymerase kan er in alle omstandigheden op binden
Gereguleerde promotor : slechts in aan- of afwezigheid van bepaalde prot/signalen gebruikt worden
Sterke promotor = veelvuldige transcriptie starten Zwakke promotor = RNA-pol bindt minder snel
▪ Bij E-coli zijn zo’n sequenties: -35- en TATA-box = -10-box
▪ De RNA-polymerase: rits de DNA-helix daar open om transcriptie te starten, schuift over DNA 3’ – 5’,
verbreekt de waterstofbruggen, leest de template streng, bouwt complementaire RNA-nucleotiden in (T
wordt vervangen door U) en zorgt voor terminatie = stopsequentie, einde van RNA-synthese, zeer weinig
over geweten (achter initiatie en elongatie)
▪ RNA polymerase subeenheden:
σ: herkenning van promotor + binding (ander soort σ-factor: hitteschok of sporevorming)
α: helpt binding op promotor (2 α-subeenheden in RNA-polymerase)
β: binden van NTP’s, antibioticum rifampicine bindt op deze subeenheid en verhinderd initiatie
β’: bindt op de template
▪ Achter binding op promotor start de transcriptie meestal op een purine (+1 plaats) genoemd = initiatie
Upstream: DNA-seqsuentie voor initiatie plaats (met negatief getal aangeduid)
Downstream: DNA-sequentie achter initiatie plaats (met positief getal angeduid)
Elongatie
▪ σ-factor laat los na de initiatie, core-enzym voert de RNA-synthese uit
▪ Ontstaan tijdelijke korte DNA-RNA hybrides
▪ RNA-polymerisatie ontwindt de DNA-helix en herstelt deze terug achter RNA-synthese
Terminatie
▪ Vaak GC-rijke DNA-sequentie in palindroom vorm bv GCCG gevolfd door zestal AT-basenparen
▪ Vormt hairpin-loop = stemloop → vertraagd RNA-synthese → RNA zal volledig loskomen → terminatie
▪ Andere klasse terminatoren: rho-afhankelijkheid, rho = helicase, duwt vormend RNA van DNA weg
Transcriptie eenheid:
DNA-regio die vanaf een promotor afgeschreven wordt tot aan de
terminator die nodig is voor de synthese van specifiek eiwit. Van deze
regio wordt het complementair mRNA dus gemaakt, de regio kan
uit 1 of meerdere genen bestaan.
▪ Bij eukaryoten: eenheid bevat 1 gen → mRNA dat voor 1 eiwit zorgt (voor rRNA kan het ook meerdere zijn)
▪ Bij prokaryoten: eenheid vaak operon = meerdere genen (polycistronisch monocistronisch)
Sequentie voor transcriptie eenheid leader of 5’UTR (untraslated region) = upstream
Sequentie na transcriptie eenheid trailer of 3’UTR = downstream
De transcriptie-eenheid omvat vaak zowel coderende als niet-coderende delen van het DNA, zoals promotor- en
terminatorsequenties
, Transcriptieproces in eukaryoten:
Bezitten grotere en meer complexe RNA-polymerasen
▪ RNA-polymerase I: productie rRNA in nucleolus (niet de 5S)
▪ RNA-polymerase II: productie mRNA en meeste snRNA en lncRNA
▪ RNA-polymerase III: productie tRNA en 5S-rRNA
Verschillen met transcriptie prokaryoten: Transcriptie-initiatie factor TIF
Initiatie complexer DNA verpakt in chromatine circulair los DNA (open structuur → euchromatine)
Transcriptiefactoren Nodig zodat RNA-polymerase kan starten zelfstandig (∉ RNA-polymerase enzymcomplex)
Promotor RNA-polymerase bindingsplaats met aantal regulatorische sequenties (stroomopwaarts)
Types polymerasen Er zijn drie types polymerase in de kern tijdens transcrptie
→ 3 types RNA, 3 bijhorende types promotor en algemene transcriptiefactoren
Terminatie Niet veel over geweten, geen precieze signalen, polyA-signaal belangrijk
Matuur RNA Bij prok heb je direct matuur RNA, bij euk eerst pre-matuur -> splicing -> matuur RNA
Elongatie Niet echt verschillen
Achter de transcriptie bij eukaryoten heb je pre-mRNA (aangemaakt door RNA-polymerase van5’ – 3’ opgebouwd),
wordt nog afgewerkt tot matuur RNA → RNA-processing (direct matuur mRNA achter terminatie bij prokaryoten)
RNA processing
Na de terminator moeten we van pre-mRNA → matuur of rijp mRNA via RNA processing
▪ Eerste stap: wordt aan 5' uiteinde een cap gehangen = 5'-cap, toevoeging van poly-A-staart (AAAA..)
--> reden: RNA is zeer onstabiel, RNA heeft korte levensduur dus moet beschermd worden maar moet heelhuids buiten de
cel gebracht worden: cap en staart, tegen bescherming bepaalde enzymen etc
▪ Tweede stap: splicing = verwijderen van introns uit RNA --> rijp/matuur mRNA
Interessante delen in gen = exons = bevatten code voor proteïne synthese (film)
Niet interessante delen = introns = niet coderende-delen van DNA die in het mRNA zitten → eruit halen d.m.v. spliceosoom
1 gen bestaat uit
verschillende exons
en introns!!! Foto
hiernaast is 1 gen (in
transcriptie-eenheid)
Onderscheiding 3 types RNA-polymerasen bij euk
Transcriptie in euk dmv RNA-polymerase II mRNA
RNA-polymerase II bindt op transcriptiefactor TFIID + binding van histonmodificerende eiwitten en
chromatinemodeleringseiwitten om euchromatine te verkrijgen → DNA toegankelijk maken
Bindingsplaats RNA-polymerase II = TATA-box = 5’ TATAAAT 3’ (-25) = basispromotor
Enchancers activeren de transcriptie (stroom op en af) en silencers die de transcriptie tegenwerken
Stroomopwaarts: CAAT-box (-80/70) en/of GC-box(-110) nodig om transcriptie te laten doorgaan
Transcriptie in euk dmv RNA-polymerase I en III rRNA en tRNA
RNA-polymerase I (rRNA-gentranscriptie)
Promotor tussen -45 en +20, TATA-box equivalent en regulatorische sequenties
RNA-polymerase III (tRNA productie
Promotor intern in gen gelegen, terminatiesignaal UUUU in GC-rijk gebied, geen stem-loop vorming nodig
, HOOFDSTUK 16 : RNA
Messenger RNA : mRNA
▪ Onstabiel
▪ Hoge turnover, nodig om regulatie toe te laten
▪ Grote lengtevariatie 100den – 10 kilobasen (meestal 1 – 2 kb)
▪ In prokaryoten
Direct matuur mRNA
Koppeling van transcriptie en translatie (eiwit wordt al gemaakt terwijl mRNA nog gemaakt wordt)
Polycistronisch (meerdere genen in transcriptie-eenheid → mRNA codeert voor meerdere eiwitten)
Halfwaardetijd 2-tal minuten
▪ In eukaryoten
Pre-mRNA eerst = heterogeen nucleair DNA = hnDNA (nog steeds in celkern)
Door RNA-processing en modificatie matuur mRNA (naar cytoplasma)
Halfwaardetijd mRNA: 6-24 uur
▪ RNA-processing
Splicing: introns verwijderen
5’ cap: bestaat uit 7-methyl-guanine die op eerste nucleotide van mRNA-keten vastzit, voor transport
van kern -> cytoplasma, bescherming tegen nucleasen en herkenningsplaats voor translatie
Polyadenylatie: poly-A-staart (200) toevoegen aan 3’ einde = posttranscriptionele modificaite (A-
reeks niet in DNA gecodeerd) gestart door polyadenylatiesingaal met sequentie 5’ AAUAAA 3’,
knipt hetgeen dat erachter komt weg, voor stabiliteit, translatie en transport
Ribosomaal RNA : rRNA
▪ Belangrijk bestandsdeel ribosomen
▪ Kleine en grote subeenheid
▪ Prok ribosoom < euk ribosoom
▪ Functie
Structureel: geraamte waarin de eiwitten opgehangen zijn
Katalyserend: in eiwitsynthese → sterk geconserveerde
▪ Bepaalde regio’s in kleine subeenheid van rRNA sterk geconserveerde sequenties → kan organismen aan
beide uiteinde van evolutieboom vergelijken, tussen die regios heb je internal transcribed spacer ITS
▪ Gebied rRNA-genen handig bij identificatie van organismen
▪ rRNA-genen = rDNA → liggen samen in 1 transcriptie-eenheid (behalve het 5S bij eukaryote)
= geheel aan DNA-sequenties dat voor rRNA codeert
Het rDNA van eukaryoten bestaat uit een tandemherhaling (clusters) van een ‘basissequentie’ die op zijn
beurt samengesteld is uit NTS-, ETS-, 18S-, ITS1-, 5.8S-, ITS2- en 28S-gebieden
Multigenenfamilie: meerdere kopijen van deze transcriptie-eenheid aanwezig, om ad grote vraag te kunnen
voldoen van rRNA. 18S/ 5,8S/ 28S transcriptie-eenheid komen in tandem herhaling (clusters) vr thv de
nucleaire organisatieregio’s (NORs) vd chromosomen (maïs: 1 paar NO, mens 5 paar NORs)
▪ Transcriptie eenheid: gen voor kleine subeenheid (16S 18S) – spacer ITS – gen voor grote subeenheid (23S 18S)
Bij prokaryoten soms tRNA-gen in spacer (krijgt dan ITS1 – tRNA-gen – ITS2)
Transcriptie en processing van rRNA
▪ Pre-rRNA → primair transcript, hierop worden rRNA-genen samen afgeschreven
▪ Matuur rRNA-moleculen door processing: endonucleolytische knippen + exonucleolytische afknabbelen
Leader- (voor), trailer- (achter) en spacer- (tss) sequenties verwijderd
▪ Verwijderen van introns:
- specifieke vorm van processing bij sommige rRNAs
- verwijderen van stukken ‘niet-coderend’ DNA middenin een gen vanuit primair transcript
▪ Methylasen → modificeren bepaalde basen in rRNA – (snoRNAs)
▪ Eukaryotische rRNA-genen → afgeschreven door polymerase l id nucleolus fl < 5S rRNA elders id kern door
RNA-polymerase lll gesythetiseerd
