H1: Inleiding
Biologische systemen: micro-organismen, plantaardige of
dierlijke cellen, tevens enzymen geïsoleerd uit levende wezens
o Micro-organismen: bv. schimmels
o Enzymen geïsoleerd uit levende wezens: bv. mRNA vaccins
Geen klassiek biotechnologisch product: niet aangemaakt in levende cellen
Het gaat niet over ‘wat is het product’ maar over ‘hoe is het aangemaakt’
o NIET: traditionele agricultuur en veeteelt
Biotechnologie: gebruik en manipulatie v. biologische systemen
o Bereiding natuurlijke grondstoffen en biomassa
o Het gaat niet over ‘wat is het product’ maar over ‘hoe is het aangemaakt’
Aanmaak via chemische synthese: chemische risico’s
Aanmaak via biologische synthese: biologische contaminanten (=stoffen die onbedoeld
ergens terechtkomen)
Vroeger: onbewust gebruik maken van bacteriën en gisten
o L. Pasteur: micro-organismen zijn verantwoordelijk voor bepaalde omzettingen
o Bv. verkeerde gisten in druiven tijdens productie wijn: omzetting in azijn ipv wijn
Fermentatie
o Afbraak nr kortere ketens suikers
o Opkoken: micro-organismen die spontaan aanwezig zijn, afdrogen
o Gisten toevoegen, gisten gebruiken suikers en zetten om naar CO 2 en alcohol
Gisten kunnen max. 12-13% alcohol aan, anders toxisch voor gistcel
Exponentiële toename v. gisten
Conc alcohol stijgt, conc gisten daalt (alcohol is afbraakproduct v. gisten)
DNA manipuleren
o Wijzigingen (in het genoom) v. bepaalde cellen
o Recombinante proteïnen aanmaken op industriële schaal
o Lichaamseigen moleculen in grote hoeveelheden
o Recombinante technieken
Vaccins, mAb & enzymen
o Gewone biologicals: bv. bloedafgeleide producten
Deel plasma opgezuiverd om als GM te gebruiken
o Biotechnologische producten: bv. bepaalde antibiotica, bepaalde vaccins
Aanmaak: micro-organismen manipuleren zonder genetische informatie te wijzigen
o Recombinante producten: bv. insuline
Menselijke eiwitten produceren + gebruiken als GM
Insuline
o Aanmaak in zeer beperkt aantal cellen
Gen dat hiervoor codeert wel aanwezig in alle cellen, maar wordt enkel geproduceerd
door β-cellen in de pancreas
o Genen in genoom worden gestuurd door promotoren
Af-/aanzetten promotoren door omgevingsfactoren, daardoor zorgen ze ervoor dat
sommige β-cellen wel insuline aanmaken en andere niet
o In het begin geen methionine (=startcodon)
, Eiwitten onderworpen aan post-translationele modificaties (eiwit synthetiseren en
wijzigen)
Stuk wegknippen van het eiwit
Start: signaalsequentie zorgt ervoor dat eiwit
ergens in het lichaam terechtkomt, wordt er
afgeknipt
o A-keten en B-keten met daartss. een connecting peptide
(posttranslationeel: wegknippen)
Insuline actief in lichaam: enkel A- en B-keten
Door disulfidebruggen aan elkaar gehouden
Interne disulfidebrug
Analyse biogene producten: belangrijk kwaliteitscontrole
o Risico op contaminatie
o Analyse eiwitten complexer dan analyse klassieke GM
H2: DNA/RNA
DNA-structuur:
Primaire structuur = polynucleotide-structuur (oligonucleotide)
o Met 3’-5’-fosfodiëster verbinding tss. nucleotiden
o Suiker-fosfaatskelet met basen gebonden op C 1’ vd. suikermolecule
o Basen bepalen DNA-sequentie
Secundaire structuur = 2 anti-parallelle ketens
o Watson en Crick model
o Dubbelstrengig
Enkele virussen enkelstrengig DNA
Gebieden v. complementariteit met zichzelf
Interne dubbele helix haarspeld structuren
o 5’ 3’
o Ketens samengehouden door H-brug vorming tss. complementaire basen
A – T (dubbel gebonden)
G – C (driedubbel gebonden)
A & G: purines
C & T: pyrimidines
Veel genomen: circulaire DNA-moleculen
o Bv. bacteriële genomen, sommige virussen, sommige bacteriofagen & plasmiden
o Plasmiden: los van eigen genoom mee overgeërfd
o Bacteriofagen: fasen in leven waarbij DNA circulair is, fasen in leven waarbij DNA niet
circulair is
o Voor delen: DNA verdubbelen
o Genoom mens: lineair, bij DNA-replicatie en celdelingen een extra probleem
NIET bij circulair genoom
Denaturatie-Renaturatie
Denaturatie
o Reversibel proces
o Originele structuur gaat verloren
o H-bruggen worden verbroken (2 strengen laten los)
, Thermisch: opwarmen & afkoelen
Onbeperkt herhalen
pH wijziging: H-brugvorming is afh. vd. pH van het milieu
pH zuur: DNA-strengen laten los
pH alkalisch: DNA-strengen komen terug samen
Te sterk zuur of te sterk alkalisch: DNA breekt af
Chemische moleculen onderhevig aan afbraakreacties
Toevoegen additionele stoffen aan buffer
DNA-strengen destabiliseren door ureum of formamide
Tm: smelttemperatuur
o Temperatuur waarbij helft vd. basen ongepaard zijn (2 strengen niet volledig los van elkaar)
o Tm stijgt naartmate [G][C] gehalte toeneemt
A-T: 2 H-bruggen worden gevormd
G-C: 3 H-bruggen worden gevormd
Hoe meer G-C bindingen, hoe stabieler de binding, hoe meer E toevoegen om ze uit
elkaar te krijgen, Tm stijgt
o Renaturatie
Gedenatureerde strengen associëren opnieuw bij 25°C onder Tm
o Volledig denatureren (afbreken, T verhogen) renaturatie tot Tm (helft basenparen
ongepaard)
Tm-waarde volgen en meten (want hoeveelheid licht verandert in enkelstrengige vs.
dubbelstrengige configuratie) zie grafiek
o Spectofotometer
o Cuvet zonder toegevoegde vloeistoffen en absorptie meten bij 260 nm
o Waarde absorptie bij kamerT = 1
o Cuvet geleidelijk aan opwarmen
o Relatieve absorptie blijft 1 (tem. 60°C blijft absorptie hetzelfde als bij kamerT)
o Verder opwarmen: absorptie neemt toe (ongeveer 1,4)
Basen in dubbelstrengige DNA molecule is in totaliteit iets minder absorberend dan
dezelfde basen in een enkelstrengige DNA molecule (enkel: absorptie stijgt)
o Tm: helft basen enkel., helft basen dubbel. (helft van de curve)
o Verder verwarmen: curve wordt plateau
Dit voorbeeld: alle DNA is enkel. geworden bij 75-80°C
Onder 94°C: niet-natuurlijk stuk DNA (poly d(A-T)), bestaat uit dubbel. dat enkel uit A-
en T-basen bestaat, enkel 2 H-bruggen)
Dit is de zwakste binding die we kunnen hebben
94°C: volledige denaturatie
Onder Tm: volledige renaturatie
Grafiek rechts: correlatie tss Tm en percentage [G][C]
o 0% [G][C]: Tm is ongeveer 70°C
o 50% [G][C]: Tm is ongeveer 90°C
o 100% [G][C]: Tm is >100°C
o 94°C: al het natuurlijk DNA uit levende organismen
is gedenatureerd
o Spectrofotometer: hoeveelheid DNA inschatten
Absorptie UV-licht
1 OD260nm = ongeveer 50 µg/ml dubbelstrengig
DNA (Wet Lambert B.) + ongeveer 33 µg/ml
enkelstrengig DNA (schatting)
Zuiverheid DNA: verhouding OD260/OD280 = 1,8 (bij zuiver DNA)
OD = optische densiteit
, Absorptiespectrum: over een range van golflengtes opnemen hvl stof absorbeert bij
desbetreffende golflengtes in grafiek
Reversibel proces
o 94°C: DNA-strengen komen los van elkaar = denaturatie
o T ver onder Tm: DNA-strengen komen terug bij elkaar = renaturatie
Renaturatie beïnvloedt door: spelen met T + toevoegen v. kationen
Hoe hoger conc. v. DNA, hoe sneller renaturatie doorgaat
Homologe renaturatie
o Met volledig stuk complementair DNA (2 complementaire strengen; geen foutieve basen)
Conc. DNA hoger sneller
Strengen dichter bij elkaar sneller
o Kationen verlagen elektrostatische afstoting renaturatie hogere Tm
2 DNA strengen: relatief hoge negatieve lading door fosfaat-suiker skelet
Fosfaatgroep erop zijn bij fysiologische pH ook negatief geladen
Kationen zorgen voor neutralisatie elektrostatische afstoting
Heterologe renaturatie
o Met niet volledig identisch of complementair stuk DNA (fout tijdens renaturatie)
o Tm: -1,4°C/per mismatch (mismatch = fout in complementariteit tss. 2 strengen)
Indien fout in complementariteit tss. 2 strengen die je samen wilt laten komen
T waarbij je renatureert moet je lager zetten dan bij homologe renaturatie
Primers toevoegen (enkelstrengig) mengen met DNA-staal patiënt (staal dat je wilt testen)
o Stukken renatureren met DNA patiënt door afkoeling tot onder Tm-waarde
o Synthetische stukken: volledig of deels complementair
DNA-replicatie = vermenigvuldigen v. DNA
Voor celdeling: beide dochtercellen die ontstaan hebben volledig genoom
o Snelheid: 50 nucleotiden/sec.
Gebeurd op iedere plaats in genoom waar replicatie start
Genoom: bestaat uit chromosomen replicatie start tegelijk op beide chromosomen
Snelheid is dus sneller: 50 nucleotiden/sec. gebeurd op verschillende plaatsen in
genoom + gaat in 2 richtingen
o DNA-basenparing: A-T, G-C
Complementariteit
o DNA-templating: DNA-strengen gaan uit elkaar tijdens replicatie
Denaturatie zonder verwarmen, dmv. enzymen
Beide strengen gebruiken als template
o DNA-polymerase
3’-5’ richting
Strengen uit elkaar trekken
Nieuwe complementaire strengen aanmaken
Exonuclease activiteit: stukje RNA primer wegknippen + vervangen door DNA-streng
Thv. Okazaki-fragmenten
o dNTPs = deoxyribonucleotide trifosfaten
Bouwstenen, voldoende nodig om snelheid v. inbouwen vd. nucleotiden te behouden
o Semi-conservatief
Nieuwe dubbele streng: nieuwe streng + oude streng
o Replicatievork
Asymmetrisch
‘leading’ streng
‘lagging’ streng
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur marthevanlerberghe. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €10,49. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
