Uitgevonden door Kary Mullis in 1983
Doel: enorme hoeveelheden kopieën genereren van welbepaalde DNA-sequentie
Waarom: genen = zeldzame doelwitten in complex genoom
PCR: genoeg van gen/dna om analyse te starten
2/ Principe van PCR
Uitgangsmateriaal PCR: DNA dat sequentie bevat die geamplificeerd dient te worden
Reactiemengsel
o DNA-polymerase
Enzym verantwoordelijk voor het uitvoeren vd reactie
Gebruikt tijdens DNA-replicatie
o 2 primers: forward & reverse
o dNTPs (A, C, G, T)
Desoxynucleotidetrifosfaten
Bouwstenen DNA
o MgCl2
Co-factor voor DNA-polymerase enzym werkt optimaal
o Buffer
Mengsel op bepaalde pH houden reactie optimaal laten doorgaan
3 stappen in PCR
o Denaturatie
o Annealing
o Elongatie
1 cyclus, n keer herhalen (afh. van aantal
keer nodig)
Denaturatie
o Reactiemengsel wordt opgewarmd tot 95°C-
96°C
o Dubbelstrengig DNA valt uiteen in 2
enkelstrengige DNA-moleculen
= Template DNA voor primers die aanhechten
Annealing
o Mengsel wordt afgekoeld tot ongeveer 60°C (afh van primers)
o Primers aangehecht aan template-DNA
o Kort stuk dubbelstrengig DNA aanwezig, nodig voor DNA-polymerase om aan te
binden
o DNA-polymerase zal adhv. Template-DNA de complementaire basen aanbrengen
Elongatie
o Bij 72°C : optimale T voor DNA-polymerasen om functie uit te voeren
, o Nieuwe gesynthetiseerde strengen strekken zich uit tot voorbij primer op
tegenovergestelde streng
o Er worden nieuwe primer-bindingsplaatsen gecreëerd op elk nieuw gesynthetiseerde
DNA-streng
Na n cycli bevat de reactie een theoretisch maximum
o 2n dubbelstrengige DNA-moleculen = kopieën van DNA-sequenties tss. beide primers
3/ Primers
Kort stuk enkelstrengig DNA, nodig om PCR reactie te starten
Synthetisch aangemaakt
2 primers nodig: forward & reverse
o Forward
Bindt op backward DNA streng
Van 3’ 5’
o Reverse
Bindt op forward DNA streng
Van 5’ 3’
Tm = smelttemperatuur
o Helft primer gebonden op DNA-template en de helft in het mengsel voorkomt als
enkelstrengige DNA-molecule
o Bepaalt annealing temperatuur (ideaal: 3/5°C lager dan laagste Tm vd. primers)
Eigenschappen goede primer
o 20-30 basenparen lang
o Unieke sequentie
Primer enkel thv. targetsequentie binnenkomen
o Ze mogen geen inverted repeats bevatten (hairpins)
Stukje in primer waarvan de complementaire sequentie al een beetje
verder in de primer ook al voorkomt
2 stukken binden aan elkaar want complementair vormt hairpin/loop
Primer kan niet meer binden op DNA-template
o Geen complementariteit tss. forward en reverse primer
Gaan primer dimers vormen
Binden op elkaar, niet meer beschikbaar om te binden op DNa-template
o 3’ uiteinde primer
Rijk aan G en C
Vormen sterkste binding met elkaar, 3 H-bruggen tov. 2 H-bruggen bij A en T
Geen misprime: niet complementair met DNA-template (aan 3’ want elke
nieuwe DNA-streng wordt gesynthetiseerd van 5’ nr. 3’)
Primer moet goed binden thv. 3’ uiteinde: van daaruit start elongatie
o Tm mag max. 3°C verschillen tss. forward en reverse primer
Hechten bij dezelfde annealingtemperatuur aan het DNA-template
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur marthevanlerberghe. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €8,49. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
