Hoofdstuk 1: DNA: Deoxyribonucleic acid
1. Inleiding
Levende organismen:
- Afgescheiden: levende organismen zijn afgescheiden van de omgeving door
celmembranen/celwanden en hun samenstelling verschilt van die van
de omgeving
- Energieopname/verbruik: energie bekomen door eten en drinken, zonlicht is voor
planten een bron van energie, die op hun beurt een bron
zijn van energie voor andere organismen
- Groei: een levend organisme neemt toe in complexiteit tot volwassen stadium,
afsterven gebeurt door ‘ouderdom’
- Voortplanting: zich vermeerderen door (a)seksuele voortplanting via ontwikkeling
van (on)bevruchte eicellen of afsplitsing
- Beweging: levende organismen bewegen zelfstandig (bv. planten richten naar de zon)
- Interpretatie prikkels: gegevens verzamelen van omgeving en erop reageren
- Communicatie: cellen communiceren d.m.v. moleculaire signalen, communicatie is
noodzakelijk voor voortbestaan leven op aarde
Levende cel:
- Eenheid van leven, kleinste deel van organismen dat +- autonoom kan overleven
- Eenheid afgescheiden van omgeving, met een georganiseerde opbouw door
wisselwerking tussen biomoleculen
- Biomoleculen: lipiden, nucleïnezuren, proteïnen en carbohydraten (kws)
- Cel slaat info op en brengt info tot expressie + geeft info door aan dochtercellen
- Prokaryote cel versus eukaryote cel
2. Mijlpalen uit de geschiedenis van de erfelijkheidsleer
2.1. Eigenschappen zijn erfelijk: de genen
Genen: info-bevattende elementen die karakteristieken van een individu en soort bevat,
coderen voor erfelijke eigenschappen
- Begin: genen als overerfbare kenmerken – studies Mendel
- Erwtenvariëteiten kruisen: lange erwten X korte erwten
- 1e generatie: 100% lange erwten (dominant)
- 2e generatie: 75% lange erwten en 25% korte erwten (recessief)
1
, - Mendel: - waarneembare eigenschappen zijn overerfbare eenheden
- elk individu bevat 2 gekoppelde genen (met meerdere allelen)
- genen zijn dominant, recessief of intermediair
2.2. Link genen en biochemische processen door Garrod
Alkaptonurie: aandoening waarbij de urine zwart kleurt als die aan lucht wordt blootgesteld
- Overervingspatroon binnen families: recessief kenmerk door defect in gen
- Urine bevat hogere concentraties homogentisinezuur, dat normaal afgebroken wordt
door een enzym, dat defect is bij alkaptonurie
- Begin onderzoek naar moleculaire verklaring van erfelijkheid
2.3. Welke stoffen bevatten de genetische informatie?
Chromosomen: draadvormige structuren die de dragers zijn van de genen
Om te onderzoeken welke stoffen de genetische info bevatten, moet men eerst de
verschillende componenten van de cel zuiveren cel fractioneren in componenten
- Cellen worden gehomogeniseerd: verschillende componenten uit cel komen in
oplossing
- Homogeniseren: detergent toevoegen aan weefsel of cellen of mechanisch breken
- Detergenten lossen membranen deels op inhoud cel komt vrij in oplossing
- Mechanisch breken: door eenvoudige mixer of sonicatie (hoge intensiteit ultrasoon
geluid doet celwanden breken)
- Cellen gehomogeniseerd oplossing verdelen in fracties door centrifuge
Differentiële (ultra)centrifuge: hoog toerental, hoge g-krachten
1) Cellen kapot maken door detergenten of door weefsels mechanisch te breken
2) Homogenaat door filter gieten en zo grote brokstukken verwijderen
3) Gefilterde homogenaat wordt met lage rotatiesnelheid gecentrifugeerd
middelpuntzoekende F groter dan Fz bij deze lage g-force worden eerst grote
celorganellen naar bodem gedreven pellet: materiaal verzamelt op de bodem,
supernatans: oplossing boven pellet
4) Pellet: in oplossing brengen in nieuwe buffer en zo apart houden
5) Supernatans: opnieuw gecentrifugeerd met hogere rotatiesnelheid, kleinere
organellen worden naar bodem gedreven (stappen worden herhaald)
Densiteitscentrifuge:
- Verschil in dichtheid/densiteit van celorganellen gebruiken
- Centrifugebuis: verschillende lagen oplossingen aanbrengen met dalende c aan
sucrose lagen mengen niet door andere densiteit
- Celhomogenaat bovenop gradiënt aanbrengen
2
, - Centrifuge: organellen migreren naar sucroseoplossingen waarvan densiteit gelijk is
aan densiteit organellen opwaartse druk = neerwaartse druk
- Einde centrifuge: organellen zweven in lagen van gradiënt
Densiteitsgradiënten: ook bv. bekomen met homogene oplossingen van bv. CsCl die bij
hoge rotatiesnelheid laten centrifugeren door hoge g-krachten zal
CsCl naar bodem gaan ontstaan concentratie-gradiënt zeer
kleine verschillen in densiteit kunnen zo gemeten worden
(bv. verschil tussen 12C en 14C)
Het experiment van Griffith (1941):
- 2 stammen van bacterie Streptococcus pneumoniae vergelijken
- S-stam: kolonies bacterie hadden een gladde vorm en veroorzaakt longontsteking
uit S-stam werd nieuwe stam ontwikkeld met een ruwere vorm
- R-stam: ruwere vorm en veroorzaakt geen longontsteking
- Griffith: homogenaat van S maken en bij bacteriën van R-stam voegen
muizen inspuiten: wel longontsteking, ookal waren de S-bacteriën dood
- Conclusie: Transformatie: bacteriën kunnen dragers van eig. uit omgeving opnemen
- Homogenaat S fractioneren: in RNA, eiwitten, DNA, vetten en KWS elk werd apart
met R-bacteriën gemengd en bij muizen ingespoten
- Enkel fractie DNA + R-stam kon transformeren naar S-vorm erfelijke eig/genen
zitten vervat in DNA!
Het Hershey-Chase experiment (1952):
- Inleiding: - faagpartikel van bacteriofaag bestaat uit eiwitmantel met een
nucleïnezuurmolecule + eiwitten
- infectie: bacterie maakt dan nieuwe faagpartikels aan en
bacteriofaageiwitten komen tot expressie + bacteriofaag DNA
wordt aangemaakt E. Coli barst open en bacteriofagen komen
in groeistadium
- Experiment:
- Cultuur 1: E. Coli infecteren met bacteriofagen + radioactief fosfaat 32P
toevoegen P ingebouwd in DNA bacteriofagen die ontwikkelen
in besmette E. Coli
- Cultuur 2: radioactief zwavel 35S toevoegen aan groeimedium, wat
ingebouwd wordt in eiwitten van bacteriofagen
- 2 aparte E. Coli culturen werden geïnfecteerd met de radioactief
bacteriofaag preparaten cultuur schudden om contact bacteriofaag en
bacterie te verbreken
- Centrifuge: E. Coli als pellet verzameld (bacteriofagen zitten in supernatans)
- E. Coli van pellet in staat nieuwe bacteriofagen te maken, omdat het de
coderende component ontvangen heeft DNA (radioactief fosfaat) bevat
info over bouwstenen bacteriofagen
- Waarnemingen: 32P zat in pellet in bacteriën en 35S bleef in oplossing achter
3
, 3. De structuur van het deoxyribonucleic acid (DNA)
3.1. DNA = suiker + fosfaat + basen
DNA: deoxyribonucleic acid, drager van erfelijk materiaal en bestaat uit lange polymeren
Deoxyribonucleïnezuur: nucleïnezuur kan voorkomen in 2 vormen, DNA en RNA
- Suiker deoxyribose = β-D-2-deoxyribose, pentose afgeleid van β-D-ribose
- Fosfaatgroepen: fosfaat is gekoppeld aan 5’ uiteinde van deoxyribose
(ribose en fosfaat wisselen af in ruggengraat)
- Nucleobasen: purines (A en G) en pyrimidines (T en C) N-houdende ringstructuren
- Nucleoside: base is verbonden aan ribose via N-β-glycosidische binding
(C1 suikerrest verbinden aan N9 van purines/N1 van pyrimidines)
adenine + ribose = adenosine, guanosine, cytidine, thymidine, uridine
- Nucleotiden: fosfaatgroep verbinden aan 5’ C (vrije nucleotiden veel in cellen)
gemaakt door meeste cellen, door partiële hydrolyse van
nucleïnezuren door nucleasen of door recuperatieproces na afbraak
van vrijgekomen basen
tot 3 fosfaatgroepen aan 5’C hangen door fosfoanhydridebindingen
= deoxyribonucleoside-tri-fosfaten dNTP’s (nucleotidetrifosfaten of
NTP’s als ribose niet gedeoxyleerd is)
fosfaatgroepen: α, β, γ β en γ kunnen afgesplitst worden door
enzymen + NTP’s zijn voornaamste overdragers biochemische E
(bv. NTP’s: koppel ATP-ADP)
- DNA-keten: ribosen verbonden via fosfodiesterbindingen 5’ C via fosfaatgroep
met 3’ C van vorige deoxyribose verbonden
Cyclisch 3’-5’-fosforzuur van adenosine cAMP (cyclische vorm van mononucleotiden) dient
als signaalmolecule in biochemische processen
cAMP: binding aan cAMP vormverandering
- Synthese door adenylaatcyclase, verbindt α-fosfaat van ATP (≠dATP) met 3’OH
uiteinde eigen ribose
- Concentratie in cel bepaald door enzymen die het aanmaken en afbreken
- cAMP fosfodiesterase zal cAMP omzetten naar AMP door hydrolyse van verbinding
tussen fosfaat en 3’OH einde ribose
Eiwitten en basen: kunnen intracellulair gemethyleerd worden, de donor voor de
methylgroep is S-adenosyl-methionine
Cafeïne: opwekkend middel in thee/koffie en is een inhibitor van fosfodiësterase, enzym dat
cAMP omzet in AMP, en de effecten van cAMP dus versterkt (lijkt op purine)
3’-azido-2’-deoxythymidine/AZT: gebruikt bij behandeling van AIDS, inhibeert enzym
(reverse transcriptase) nodig voor replicatie virus
Biomoleculen met basen en nucleosiden: coënzyme A (acyltransfer reacties),
NAD (elektrontransfer) en FAD (elektrontransfer)
4
