Samenvatting Dialyse, eiwitscheidingstechnieken en chromatografie

Life Science Samenvatting Course 5
Introductie
De onderwerpen van deze course:
- Eiwitscheidingstechnieken
- Eiwitstructuren
- Signaaltransductie
- Hemoglobine
De PowerPoints zijn leidend. Gebruik de boeken als naslag werk.
Het tentamen is een mix van meerkeuze en openvragen, met vooral openvragen.


Eiwitten
Aminozuren (die hele lijst) komen ook weer in de Course 5 toets.
Functies van eiwitten:




- Je moet de verschillende functies kennen


Eiwitten scheiden:
- Je kunt eiwitten van elkaar scheiden

, - Maar ook eiwitten van onzuiverheden scheiden
Eiwitten worden gescheden omdat het nodig is om eiwitten te scheiden van andere eiwitten
of onzuiverheden om ze te kunnen bestuderen. Als je bijvoorbeeld de functie van een eiwit
wil weten, dan moet je dat eiwit eerst zuiveren zodat je niet last hebt van andere eiwitten.
Wanneer je bijvoorbeeld bacteriën insuline hebt laten maken, dan moet dat insuline
gescheden worden van de andere eiwitten die de bacterie ook produceert voordat het
gebruikt kan worden.
Scheidingstechnieken die je moet kennen:
1. Dialyse
2. 1D SDS-PAGE
3. 2D IEF-SDS-PAGE
4. Chromatography:
• Ion exhange
• Size exclusion
• Affinity Chromatography
5. HPLC


Dialyse:
Dialyse ken je misschien als techniek in het ziekenhuis:




- Wanneer bij een patiënt de nieren niet goed functioneren, dan kan een machine de
nierfunctie overnemen (dus het bloed filteren, en onzuiverheden eruit filteren).
Een dialyse is een eiwitscheidingstechniek, want je haalt onzuiverheden uit mengsels.

,Hoe dialyse werkt (in het algemeen):




- Dialyse is scheiding met gebruik van een semi-permeabel membraan. Een semi-
permeabel membraan is een membraan dat bepaalde stoffen doorlaat, en andere
weer niet. Dat komt doordat het membraan poriën heeft die maar een bepaalde
grootte hebben. Sommige stoffen kunnen daardoor wel door het membraan, andere
weer niet.
- In de afbeelding wordt gebruikgemaakt van een slangetje (dat gele ding), die aan de
boven en onderkant is dicht geklemd. In het slangetje zit een mengsel met grotere
(eiwitten, de rode bolletjes) en kleinere stoffen (onzuiverheden, de blauwe bolletjes).
- Door het slangetje in zuiverwater te leggen, gaan de kleine onzuiverheden uit het
membraan, waardoor er binnen het membraan de groter stoffen (eiwitten) zullen
overblijven (diffusie). De eiwitten worden hierdoor zuiverder, maar je zult nooit
compleet zuivere eiwitten overblijven.


1D SDS-PAGE:
Sodium Dodecyl Poly Acrylamide Gel Electroforese (de 1D staat voor één dimensie).
Het is een analytische techniek, dat wil zeggen dat de techniek wordt gebruikt om eiwitten te
analyseren. Ook beïnvloed deze techniek de eiwitstructuren, waardoor de eiwitten hun
functie verliezen (de eiwitten zijn na de tijd dus niet meer te gebruiken).
Het is een techniek die eiwitten van elkaar kan scheiden. Wanneer je een oplossing hebt met
verschillende eiwitten, dan kun je de eiwitten met deze techniek scheiden, dat gebeurt op
basis van grootte.
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) is een bepaalde stof die gebruikt wordt bij deze techniek.
SDS wordt toegevoegd aan het eiwitmengsel, voordat het door de gel heen wordt getrokken.
SDS doet het volgende:
- Maakt de eiwitten beter oplosbaar
- Geeft de eiwitten (dezelfde) negatieve lading
- Denatureerd en geeft de eiwitten dezelfde vorm
Hierdoor wordt er alleen gescheden op grootte, en is bijvoorbeeld vorm of lading niet van
invloed op de scheiding.

, - Voor deze techniek gebruik je een gel. Boven in de gel heb je poriën waarop je je
eiwitmengsel kunt laden. Vervolgens wordt er een elektrische stroom door de gel
gevoerd, van - naar +.
- De eiwitten in het mengsel worden dan door de gel heen getrokken. De gel zelf is
poreus en zit vol met kanaaltjes. De kleinere eiwitten worden makkelijker door de gel
heen getrokken, en de grotere eiwitten lastiger. De grotere eiwitten zullen zich dus
boven in de gel bevinden, de kleinere onder in de gel.
- Het resultaat kun je daarvan bekijken. Elk bandje is daarin een eiwit.
Eiwitten hebben een bepaalde grootte, die word aangegeven in het gewicht van dat eiwit
(molecular weight). De eenheid is Dalton (of kilo Dalton).

, Er kan dus een groot verschil zitten in de gewichten van eiwitten, en dat kan worden gebruikt
om onbekende eiwitten te identificeren.
Om nou een conclusie te trekken uit je resultaten, kun je een ladder toevoegen. Een ladder
is een eiwitmengsel waarvan je weet welke eiwitten er inzitten, en hoe groot die eiwitten zijn.




- Door een ladder te gebruiken met eiwitten van verschillende, bekende, groottes kun
je de grootte van de onbekende eiwitten uit het mengsel afleiden met behulp van de
ladder.


2D IEF-SDS-PAGE:
Isoelectric Focussing Sodium Dodecyl Poly Acrylamide Gel Electroforese (2D staat voor 2
dimensies).
Deze scheidingstechniek scheid eiwitten op basis van twee factoren. De 1D scheidde de
eiwitten alleen op basis van grootten, maar de 2D doet op basis van grootte EN
isoelectrische punten (pI).
Het stuk SDS-PAGE gaat over het scheiden op basis van grootte, IEF gaat over het
scheiden op basis van isoelectrische punten.


Het isoelectrisch punt van een molecuul is de pH waarbij het molecuul (eiwit in dit geval) een
netto lading heeft van 0. Dus de pH waarbij het molecuul even veel positieve als negatieve
lading heeft (maar alsnog kan er plaatselijk wel lading zijn in het molecuul).
Deze scheidingsmethode gebeurt ook met een gel. Op die gel is een pH gradiënt. Wanneer
er een stroom door de gel gaat lopen, gaan de eiwitten migreren tot de pH van hun pi, dus
waar ze een netto lading van 0 hebben.