Dit document bevat alle nodige theorie voor het theoretisch examen van het vak geïntegreerd practicum: moleculaire biologie en genetica, gedoceerd in 3e bachelor BMW. Niet alleen zijn ze primordiaal voor het theoretisch examen ook zijn ze zeer handig tijdens het practicum zelf om de theorie achter...
GEÏNTEGREERD
PRACTICUM:
MOLECULAIRE
BIOLOGIE EN
GENETICA
3e Bachelor Biomedische Wetenschappen
Universiteit Antwerpen
Gedoceerd door:
Eva Geuens
,EXPERIMENT 1: SEQUENCTIEBEPALING VAN EEN ONBEKEND GEN
1. DNA-EXTRACTIE UIT SPEEKSEL M.B.V. ZOUTPRECIPITATIE
- Vertrekken van eigen speeksel
- Verschillende mogelijkheden om DNA te extraheren
o IsolaKe kit met spinkolommen à kolommen blokkeren doordat er veel cellen verzameld worden
o Fenol-chloroform à fasescheiding tussen fenol, chloroform en water
§ ¹ veilig (toxisch, milieubelastend) product
o Extrac'e van DNA uit speeksel via zoutprecipita'e
§ Cellen intact collecteren à beetje ‘kauwen’ op wang + mond spoelen met fysiologische zoutoplossing
§ Hierna centrifugeren (om cellen te collecteren)
• Vaste hoek rotor: cellen tegen de kant worden gekatapulteerd, kans op breken
• Swinging bucket (swing out) rotor: sedimentaKeafstand is langer à veel minder cel lysis
§ Cellen (celmembraan (bevat lipiden)) met lysisbuffer openbreken
• Bufferende component: Tris
• EDTA, SDS (detergent: gaat cellen breken), NaCl
• Verwarmen zodat cellen goed kunnen breken
§ Volledige celinhoud (eiwi\en + DNA + lipiden …) komt vrij
• Enkel geïntresseerd in het DNA, niet in de eiwi\en (= contaminerende factor)
• PKA toevoegen à A`raak eiwi\en (‘stukknippen’)
• Nu zoutprecipitaKe (met verzadigd NaCl) à eiwi\en laten neerslaan
o Normaal: watermantel rondom de eiwi\en in de oplossing
o Door toevoegen zout (NaCl) zal ook rondom het zout een watermantel verschijnen
o CompeKKe tussen zout en eiwi\en voor watermantel
§ Zout zal uiteindelijk de watermantal van de eiwi\en on\rekken
§ Hierdoor slaan de eiwi\en neer
o Zout ¹ sterk genoeg om watermantel rondom DNA (sterk negaKef) te verbreken
§ DNA blija dus wel in de oplossing (supernatans)
o Door organisch solvent (ethanol): watermantel rondom DNA doorbreken
§ Mengen door 1 keer epje te kantelen
§ Idealiter in midden epje: viskeuze masse (‘sno\ebel’) + luchtbelletjes rond
§ Opvissen met glazen haakje (posiKeve lading zorgt dat DNA plakt)
§ DNA opnieuw oplossen in TE-4 buffer
2. CONCENTRATIEBEPALING M.B.V. SPECTROFOTOMETRIE
Van l-faag DNA wordt seriële verdunningsreeks gemaakt
- Via spectrofotometrie wordt vanuit verdunningen concentraKes gemeten
- Deze concentraKes uitze\en in grafiek (x = verdunning / y = concentraKe)
- Vanuit ijklijn van de grafiek kan dan de originele DNA-concentraKe van het l-faag DNA berekend worden (met x = 1)
Eigen DNA stalen ook in spectrofotometer
- DNA heea absorpKemaximum bij 260nm
o Voor dsDNA geldt: 1 OD260nm = 50 µg/ml (voor ssDNA of RNA geldt: 1 OD260nm = 40 µg/ml)
o A.d.h.v. de bekomen OD-waarde uit de spectrometrie kan dan zelf berekend worden wat de concentraKe is
- Controleren zuiverheid van de DNA stalen (contaminaKe van resterende eiwi\en in de oplossing uitsluiten)
o Eiwi\en hebben absorpKemaximum bij 280nm
o Verhouding (raKo) 260/280 wordt berekend (wel nog bepaalde absorpKe vd nucleoKden bij 280)
o Als dit getal zich tussen de range van 1,8 en 2,0 bevindt à zuiver DNA staal (>1,8: contaminaKe door eiwi\en)
- Spectrofotometer zet OD-waarden automaKsch om in concentraKe
o Deze waarden anders dan diegene die je zou bekomen door de 1 OD260nm = 50 µg/ml regel te gebruiken
o Spectrofotometer heea nog extra interne referenKe-, correcKemeKng, waardoor deze nauwkeuriger is!
1
, 3. CONTROLE DNA ZUIVERHEID EN CONCENTRATIE
Visueel kan ook concentraKe en zuiverheid gecontroleerd worden
- Kwaliteit van het DNA is belangrijk!
o Als DNA volledig gefragmenteerd is, zal er in de volgende stap (PCR) geen resultaat verkregen worden
Scheiding gebeurt m.b.v. agarose gelelektroforese
- Scheiding o.b.v. aantal bp in een elektrisch veld
o Kleine fragmenten migreren sneller doorheen de gel, grote blijven achter bovenaan de gel
- DNA is negaKef geladen à aangetrokken tot posiKeve pool (onderaan gel)
- Hoe hoger percentage vd agarosegel, hoe kleiner de poriën à hoe kleiner fragmenten die gescheiden kunnen scheiden
o Meestal tussen 0,8 en 2,0%
§ 0,8 – 1,0% = klein percentage à voor grote fragmenten (faag, eigen DNA) (1000bp – 30.000bp)
§ 1,0 – 1,5% = groot percentage à voor kleinere fragmenten (500bp – 10.000bp)
- Bovenaan de gel zou 1 duidelijk intens (fel) bandje zichtbaar moeten zijn (feller = hogere concentraKe)
o Indien bandje verspreid is over gel (bandjes bij veel verschillende moleculaire gewichten = smeer) zal het DNA
volledig gefragmenteerd zijn à niet goed
- Visualiseren van het DNA gebeurt met DNA intercalerende moleculen die in de agarosegel gepipe\eerd worden
o Gouden standaard = ethidiumbromide à zeer toxisch, mutageen
o Wij: GelRed = minder toxisch à gebruik handschoenen toch verplicht (ookal zegt fabrikant niet toxisch)
o Zal oplichten bij UV licht
4. PCR AMPLIFICATIE VOOR ONBEKENDE GEN
A LG E M E E N P R I N C I P E P C R
- Meestal reeks van 20-40 herhaalde temperatuurwisselingen (= thermische cycli genoemd)
- Gebruikte temperaturen en duur vd cycli arankelijk van verschillende parameters
o Enzym dat wordt gebruikt voor DNA-synthese à Taq polymerase
o De concentraKe tweewaardige ionen en dNTPs in de reacKe
o Smel\emperatuur (Tm) vd primers (primers moeten eerst ontwikkeld en besteld worden
Denatura'e:
- Verwarmen van de reacKekamer (94°C)
- Hierdoor denatureerd het DNA
o H-bruggen tussen complementaire basen te verbreken
o hierdoor ontstaan twee enkelstrengs DNA-strengen ontstaan.
2
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur StudentBi0med. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €5,99. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
