Samenvatting immunochemie: Analytische toepassingen, 2e bachelor biomedische wetenschappen

Flowcytometrie: Analytische toepassingen

Immunofenotypering



Grafiek:

 Rechts bovenaan: percentage CD45+ en CD34+
 Rechts onderaan: percentage CD45+ en CD34-
 Links bovenaan: percentage CD45- en CD34+
 Links onderaan: percentage CD45- en CD34-




Intracellulaire antigenen, intracellulaire cytokines, cytokinesecretie assays, flow microsfeer
immunoassays

 T-lymfocytfunctie assay

Cytokines: kleine gesecreteerde proteïnen geproduceerd door lymfocyten als antwoord op een
immuunstimulus, binden op specifieke membraanreceptoren

Fluorescence Microsphere Immuno Assay (FMIA) of Cytometric Bead Array multiplex assay (CBA)

 Meten hoeveel INF of IL4 er wordt geproduceerd: lichtrood = IL2,
donkerrood = IL6
 Focussen op array (=veelvuldige cytokines)
 Alle beats worden toegevoegd aan het celkweekmedium van de t-cel ->
cytokines gaan binden op antilichamen gecoat op microsfeer
 Sandwich ELISA: primaire en secundaire antilichamen gaan elk langs
een kant binden op het cytokine -> secundair antilichaam met andere
kleurfluorescentie gelabeld -> maat voor hoeveel cytokine er gebonden
heeft: hoe meer secundair antilichaam gebonden, hoe geler

Detectie van antigenspecifieke T-cellen: intracellulaire cytokinekleuring

Welke obstakels moeten worden overwonnen als we antigenen ook intracellulair willen meten
met de flowcytometer?

1) Celstimulaties op korte termijn: T-cel moet worden getriggerd om geactiveerd te worden:
antigen aanbieden
 Polyklonale stimulatie: mitogenen kunnen heel sterk de cel activeren
 Specifieke, monoklonale stimulatie: peptides, virussen, bacteriën
2) Snelle secretie van cytokines:
Cel slaagt cytokines niet op in de cel, gaat cytokines uitstoten om snel te kunnen reageren
tegen gevaar (willen we niet, want we willen de cytokines kunnen meten en weten welke
cellen cytokines produceren)  eiwittransport blokkeren in cel  cellen niet meer in staat
om tot eiwitsecretie over te gaan  opstapeling cytokines in cel  veel cytokine waarin we
geïnteresserd zijn

,  Monensine (thv golgi) en brefeldine (thv ER): inhibitoren eiwittransport

Nadeel: beide moleculen zijn toxisch voor de cel  afweging maken hoe lang cellen behandelen
zodat cytokine wel gemeten kan worden maar cel niet dood gaat

3) Celfixatie en -permeabilisatie
Cytokines opgestapeld in cel: antilichamen tot bij eiwitten in cel te krijgen -> binden op
antilichamen op cel, geraakt niet zomaar over plasmamembraan  celmembraan
permeabiliseren met detergent  gaten waardoor antilichamen naar binnen kunnen  kan
ook veel uit
 eerst cel fixeren: aldehyden: paraformaldehyde zorgt ervoor dat alle structuren in de
cel verbonden is met elkaar en niks naar buiten kan lekken
 saponine: gebruiken als je enkel door plasmamembraan wil komen
 alcoholen: gebruiken als je ook door kernmembraan wil geraken

Nadelen:

 Alle lichtverstrooiingsinformatie van de cel verliezen -> 1 populatie op scatter
 Signaal tov achtergrondruis is veel lager: wil niet-gebonden antilichamen wegwassen
-> niet efficïent wegwassen = veel achtergrondfluorescentie
Kan niet goed wegwassen door fixatie  meer efficïente wasstappen

Fosfo-specifieke antilichamen

Kijken wanneer pathway in gang wordt gezet: antilichamen
die fosfo-specifiek zijn

Pathway wordt geactiveerd: eiwitten worden
gefosforyleerd  Kijken wanneer bv tyrosine kinase is
gefosforyleerd




Cel “signalling”: Ca2+, pH, membraan en mitochondriale potentiaal

Hoe meten we celactivatie (=kortstondige toename calcium) mbv fluorescente merkers?

Algemene eigenschappen Probes voor cellulaire activatie:

 Membraanpermeabel: nodig want calcium zit in de cel
 Nadeel: makkelijk van binnen naar buiten migreren zorgt voor lekkage -> lading
geven dus gevangen in de cel
 Vaak acetomethylesters
 Geen compartimentalisatie: probes vrij in cytoplasma
 Hydrolyse door intracellulaire esterases
 Nadeel: onvolledige hydrolyse + toxische hydrolyse producten
 Vlugge respons op transiënte verandering
 Geen interferentie met de te sonderen respons of met andere celfuncties

Probes gaan binden met calcium  krijgen fluorescente kenmerken  calcium stijgt heel snel 
cascade andere pathways in gang zetten  mag niet blokkeren  probe mag niet interfereren met
reactie calcium en acties die calcium in gang zet