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Samenvatting Biomedische basistechnieken - deel Mobib €16,64   Ajouter au panier

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Samenvatting Biomedische basistechnieken - deel Mobib

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Deze samenvatting bevat alle opdrachten en onderzoekslijnen van het deel mobib van het vak biomedische basistechnieken.

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  • 18 mai 2024
  • 38
  • 2023/2024
  • Resume
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chaima2
Mobi biomedische basistechnieken

Inhoud
Inleiding : opdracht 1............................................................................................................................... 4
Interleukine 1 ...................................................................................................................................... 4
Humaan EVL ........................................................................................................................................ 5
Onderzoekslijn 1 ...................................................................................................................................... 6
Doel ..................................................................................................................................................... 6
Opdracht 2 : DEEL A : Vergelijkende analyse van gebruikte plasmiden .............................................. 6
BASISTERMINOLOGIE ...................................................................................................................... 6
ANALYSE VAN DE SEQUENTIE VAN VECTOR pET30a ........................................................................ 7
ANALYSE SELECTABLE MARKER........................................................................................................ 7
ANALYSE EXPRESSIEPLASMIDE pET30-hIL-1B .................................................................................. 7
EXTRA UITLEG .................................................................................................................................. 7
SOP 1 : LB-agar platen gieten .............................................................................................................. 8
INLEIDING ........................................................................................................................................ 8
BENODIGDHEDEN ............................................................................................................................ 8
PROTOCOL ....................................................................................................................................... 8
SOP 2 : transformatie van bacteriën.................................................................................................... 9
INLEIDING ........................................................................................................................................ 9
BENODIGDHEDEN ............................................................................................................................ 9
PROTOCOL ....................................................................................................................................... 9
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 10
Opdracht 2 : DEEL B : in silico voorbereiden van colony PCR ............................................................ 10
PRIMERS ANALYSE ......................................................................................................................... 10
SOP 3 : Colony PCR ............................................................................................................................ 10
INLEIDING ...................................................................................................................................... 10
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 10
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 11
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 11
Opdracht 2 : DEEL C : in silico restrictiedigest van de plasmiden ...................................................... 11
RESTRICTIEDIGEST ......................................................................................................................... 11
DIGEST IN SILICO............................................................................................................................ 12
SOP 4 : Miniprep : plasmide DNA-bereiding ..................................................................................... 12
INLEIDING ...................................................................................................................................... 12
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 13


1

, PROTOCOL ..................................................................................................................................... 13
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 14
SOP 5 : Restrictiedigest ...................................................................................................................... 14
INLEIDING ...................................................................................................................................... 14
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 14
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 14
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 15
SOP 6 : Agarosegelelektroforese ....................................................................................................... 15
INLEIDING ...................................................................................................................................... 15
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 16
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 16
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 16
Resultaten onderzoekslijn 1 .............................................................................................................. 16
Onderzoekslijn 2 .................................................................................................................................... 17
Doel ................................................................................................................................................... 17
Opdracht 3 : DEEL A : inductie van recombinante eiwitproductie .................................................... 17
EIGENSCHAPPEN VAN RECOMBINANTE EIWITPRODUCTIE ........................................................... 17
EXTRA REGULERENDE ELEMENTEN ............................................................................................... 18
AANSWITCHEN VAN RECOMBINANTE EIWITPRODUCTIE .............................................................. 18
ANALYSE VAN RECOMBINANTE EXPRESSIE.................................................................................... 19
RECOMBINANTE EXPRESSIE VAN HUMAAN EVL ........................................................................... 20
SOP 7 : SDS-page ............................................................................................................................... 20
INLEIDING ...................................................................................................................................... 20
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 21
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 22
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 22
Resultaten onderzoekslijn 2 .............................................................................................................. 22
Opdracht 4 : Kloneren via benchling voor in silico ............................................................................ 22
STAP 1 : VOORBEREIDING .............................................................................................................. 22
STAP 2 : IN SILICO KNIPPEN EN PLAKKEN ...................................................................................... 23
Onderzoekslijn 3 .................................................................................................................................... 26
Doel ................................................................................................................................................... 26
Opdracht 3 : DEEL B : recombinante eiwitproductie ......................................................................... 26
TAGGEN VAN hIL-1B EN EVL EIWIT ................................................................................................ 26
ROL VAN TAGGING BIJ EIWITZUIVERING VIA AFFINITY PURIFICATION ......................................... 26
SOP 8 : concentratiebepaling : Bradford assay .................................................................................. 27

2

, INLEIDING ...................................................................................................................................... 27
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 28
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 28
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 28
SOP 10 : ELISA variant voor humaan EVL .......................................................................................... 29
INLEIDING ...................................................................................................................................... 29
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 31
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 31
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 32
Resultaten onderzoekslijn 3 .............................................................................................................. 32
Onderzoekslijn 4 .................................................................................................................................... 33
Doel : ................................................................................................................................................. 33
Opdracht 6 : ....................................................................................................................................... 33
SOP 9 : ............................................................................................................................................... 35
INLEIDING ...................................................................................................................................... 35
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 36
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 36
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 37
Resultaten onderzoekslijn 4 .............................................................................................................. 37
Opdracht 5 : ....................................................................................................................................... 37
3D-STRCUTUUR VAN EVL EIWIT .................................................................................................... 37
3D STRUCTUUR VAN HUMAAN IL-1B ............................................................................................ 37
3D STRUCTUUR VAN COMPLEX HUMAAN IL-1B EN MEMBRAANRECEPTOR ................................ 38
AMINOZUREN IN RECEPTOR EN LIGAND ....................................................................................... 38




3

, Inleiding : opdracht 1
Interleukine 1
Interleukine 1 (IL-1) is een pro-inflammatoire cytokine die essentieel is voor de communicatie binnen
het immuunsysteem. Het wordt geproduceerd door immuuncellen en speelt een belangrijke rol bij
het reguleren van de aangeboren immuniteit. IL-1 bevordert onder andere T-cel activatie,
collageenproductie en fibroblastproliferatie, en veroorzaakt een stijging van de lichaamstemperatuur.

Het gen interleukine 1 beta (IL1B) codeert voor een inactief precursor-eiwit genaamd pro-IL-1β. Dit
eiwit wordt wanneer het protease caspase-1 inwerkt heomzet in het actieve IL-1β-eiwit, dat
vervolgens door cellen wordt uitgescheiden. Het actieve IL-1β-eiwit bestaat uit één domein en verlaat
de cel niet via de normale secretorische route vanwege het ontbreken van een signaalpeptide.

IL-1β bindt aan transmembraanreceptoren die heterodimeren vormen, namelijk de primaire
membraanreceptor IL-1R1 (Interleukine 1 receptor type I) en de coreceptor IL-1R3 (Interleukine-1
receptor accessory protein, IL-1RacP). Samen vormen ze het IL-1-receptorencomplex. Wanneer IL-1β
bindt aan IL-1R1, induceert dit een conformationele verandering die IL-1R1 in staat stelt te binden
aan IL-1R3, wat leidt tot dimerisatie van het receptorcomplex.

Receptorheterodimerisatie (receptor-ligand binding) :
1) contact met extracellulair deel van IL-1R1 receptor (PDB code : 1ITB)
Deze eiwit-eiwit-interactie gebeurt met hoge affiniteit (lage KD (dissociatieconst), nM)
2) Induceert een conformationele verandering in de primaire receptor.
3) Hierdoor kan IL-1R1 binden op de co-receptor IL-1R3 (= IL-1RacP).
 Resulteert in de cel in interactie van het receptorcomplex met cytoplasmatische
signaaleiwitten. Hierdoor start een complexe signaalcascade
 Dit resulteert uiteindelijk in de activatie van transcriptiefactoren, waaronder de
transcriptiefactor Nucleaire Factor kappa-B : NF-κB

Deze receptor-ligandbinding initieert een complexe signaalcascade binnen de cel, resulterend in de
activering van transcriptiefactoren zoals Nucleaire Factor kappa-B (NF-κB). NF-κB activeert genen die
betrokken zijn bij inflammatie en immuunresponsen.

Een natuurlijke regulator van IL-1β is IL-1Ra (Interleukine 1 receptor antagonist), die kan binden aan
IL-1R1 zonder dimerisatie met IL-1R3 te veroorzaken. Hierdoor wordt receptoractivatie voorkomen en
wordt intracellulaire signalisatie geblokkeerd. IL-1Ra werkt dus als een competitieve inhibitor van
IL-1β.

Een overmatige expressie van IL-1β is geassocieerd met verschillende inflammatoire aandoeningen.
Om deze reden worden IL-1β-antagonisten in de kliniek gebruikt voor de behandeling van
aandoeningen zoals reumatoïde artritis. Bovendien wordt onderzocht of het remmen van IL-1β een
rol kan spelen bij de behandeling van atherosclerose en verschillende vormen van kanker.

Gen Transcript Precursor eiwit Mature eiwit
Interleukine 1 beta 1507 bp Interleukine 1 beta Intracellulair :
proprotein gesecreteerd
IL1B 7 exonen 269 AZ 153 AZ
Chromosoom 2 CDS : 88-897 17,4 kD (Da = g/mol)
B- streng configuratie



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