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Samenvatting Biomedische basistechnieken - deel Mobib
- Établissement
- Universiteit Gent (UGent)
Deze samenvatting bevat alle opdrachten en onderzoekslijnen van het deel mobib van het vak biomedische basistechnieken.
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Mobi biomedische basistechniekenInhoud
Inleiding : opdracht 1............................................................................................................................... 4
Interleukine 1 ...................................................................................................................................... 4
Humaan EVL ........................................................................................................................................ 5
Onderzoekslijn 1 ...................................................................................................................................... 6
Doel ..................................................................................................................................................... 6
Opdracht 2 : DEEL A : Vergelijkende analyse van gebruikte plasmiden .............................................. 6
BASISTERMINOLOGIE ...................................................................................................................... 6
ANALYSE VAN DE SEQUENTIE VAN VECTOR pET30a ........................................................................ 7
ANALYSE SELECTABLE MARKER........................................................................................................ 7
ANALYSE EXPRESSIEPLASMIDE pET30-hIL-1B .................................................................................. 7
EXTRA UITLEG .................................................................................................................................. 7
SOP 1 : LB-agar platen gieten .............................................................................................................. 8
INLEIDING ........................................................................................................................................ 8
BENODIGDHEDEN ............................................................................................................................ 8
PROTOCOL ....................................................................................................................................... 8
SOP 2 : transformatie van bacteriën.................................................................................................... 9
INLEIDING ........................................................................................................................................ 9
BENODIGDHEDEN ............................................................................................................................ 9
PROTOCOL ....................................................................................................................................... 9
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 10
Opdracht 2 : DEEL B : in silico voorbereiden van colony PCR ............................................................ 10
PRIMERS ANALYSE ......................................................................................................................... 10
SOP 3 : Colony PCR ............................................................................................................................ 10
INLEIDING ...................................................................................................................................... 10
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 10
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 11
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 11
Opdracht 2 : DEEL C : in silico restrictiedigest van de plasmiden ...................................................... 11
RESTRICTIEDIGEST ......................................................................................................................... 11
DIGEST IN SILICO............................................................................................................................ 12
SOP 4 : Miniprep : plasmide DNA-bereiding ..................................................................................... 12
INLEIDING ...................................................................................................................................... 12
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 13
1
, PROTOCOL ..................................................................................................................................... 13
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 14
SOP 5 : Restrictiedigest ...................................................................................................................... 14
INLEIDING ...................................................................................................................................... 14
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 14
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 14
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 15
SOP 6 : Agarosegelelektroforese ....................................................................................................... 15
INLEIDING ...................................................................................................................................... 15
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 16
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 16
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 16
Resultaten onderzoekslijn 1 .............................................................................................................. 16
Onderzoekslijn 2 .................................................................................................................................... 17
Doel ................................................................................................................................................... 17
Opdracht 3 : DEEL A : inductie van recombinante eiwitproductie .................................................... 17
EIGENSCHAPPEN VAN RECOMBINANTE EIWITPRODUCTIE ........................................................... 17
EXTRA REGULERENDE ELEMENTEN ............................................................................................... 18
AANSWITCHEN VAN RECOMBINANTE EIWITPRODUCTIE .............................................................. 18
ANALYSE VAN RECOMBINANTE EXPRESSIE.................................................................................... 19
RECOMBINANTE EXPRESSIE VAN HUMAAN EVL ........................................................................... 20
SOP 7 : SDS-page ............................................................................................................................... 20
INLEIDING ...................................................................................................................................... 20
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 21
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 22
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 22
Resultaten onderzoekslijn 2 .............................................................................................................. 22
Opdracht 4 : Kloneren via benchling voor in silico ............................................................................ 22
STAP 1 : VOORBEREIDING .............................................................................................................. 22
STAP 2 : IN SILICO KNIPPEN EN PLAKKEN ...................................................................................... 23
Onderzoekslijn 3 .................................................................................................................................... 26
Doel ................................................................................................................................................... 26
Opdracht 3 : DEEL B : recombinante eiwitproductie ......................................................................... 26
TAGGEN VAN hIL-1B EN EVL EIWIT ................................................................................................ 26
ROL VAN TAGGING BIJ EIWITZUIVERING VIA AFFINITY PURIFICATION ......................................... 26
SOP 8 : concentratiebepaling : Bradford assay .................................................................................. 27
2
, INLEIDING ...................................................................................................................................... 27
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 28
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 28
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 28
SOP 10 : ELISA variant voor humaan EVL .......................................................................................... 29
INLEIDING ...................................................................................................................................... 29
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 31
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 31
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 32
Resultaten onderzoekslijn 3 .............................................................................................................. 32
Onderzoekslijn 4 .................................................................................................................................... 33
Doel : ................................................................................................................................................. 33
Opdracht 6 : ....................................................................................................................................... 33
SOP 9 : ............................................................................................................................................... 35
INLEIDING ...................................................................................................................................... 35
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 36
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 36
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 37
Resultaten onderzoekslijn 4 .............................................................................................................. 37
Opdracht 5 : ....................................................................................................................................... 37
3D-STRCUTUUR VAN EVL EIWIT .................................................................................................... 37
3D STRUCTUUR VAN HUMAAN IL-1B ............................................................................................ 37
3D STRUCTUUR VAN COMPLEX HUMAAN IL-1B EN MEMBRAANRECEPTOR ................................ 38
AMINOZUREN IN RECEPTOR EN LIGAND ....................................................................................... 38
3
, Inleiding : opdracht 1
Interleukine 1
Interleukine 1 (IL-1) is een pro-inflammatoire cytokine die essentieel is voor de communicatie binnen
het immuunsysteem. Het wordt geproduceerd door immuuncellen en speelt een belangrijke rol bij
het reguleren van de aangeboren immuniteit. IL-1 bevordert onder andere T-cel activatie,
collageenproductie en fibroblastproliferatie, en veroorzaakt een stijging van de lichaamstemperatuur.
Het gen interleukine 1 beta (IL1B) codeert voor een inactief precursor-eiwit genaamd pro-IL-1β. Dit
eiwit wordt wanneer het protease caspase-1 inwerkt heomzet in het actieve IL-1β-eiwit, dat
vervolgens door cellen wordt uitgescheiden. Het actieve IL-1β-eiwit bestaat uit één domein en verlaat
de cel niet via de normale secretorische route vanwege het ontbreken van een signaalpeptide.
IL-1β bindt aan transmembraanreceptoren die heterodimeren vormen, namelijk de primaire
membraanreceptor IL-1R1 (Interleukine 1 receptor type I) en de coreceptor IL-1R3 (Interleukine-1
receptor accessory protein, IL-1RacP). Samen vormen ze het IL-1-receptorencomplex. Wanneer IL-1β
bindt aan IL-1R1, induceert dit een conformationele verandering die IL-1R1 in staat stelt te binden
aan IL-1R3, wat leidt tot dimerisatie van het receptorcomplex.
Receptorheterodimerisatie (receptor-ligand binding) :
1) contact met extracellulair deel van IL-1R1 receptor (PDB code : 1ITB)
Deze eiwit-eiwit-interactie gebeurt met hoge affiniteit (lage KD (dissociatieconst), nM)
2) Induceert een conformationele verandering in de primaire receptor.
3) Hierdoor kan IL-1R1 binden op de co-receptor IL-1R3 (= IL-1RacP).
Resulteert in de cel in interactie van het receptorcomplex met cytoplasmatische
signaaleiwitten. Hierdoor start een complexe signaalcascade
Dit resulteert uiteindelijk in de activatie van transcriptiefactoren, waaronder de
transcriptiefactor Nucleaire Factor kappa-B : NF-κB
Deze receptor-ligandbinding initieert een complexe signaalcascade binnen de cel, resulterend in de
activering van transcriptiefactoren zoals Nucleaire Factor kappa-B (NF-κB). NF-κB activeert genen die
betrokken zijn bij inflammatie en immuunresponsen.
Een natuurlijke regulator van IL-1β is IL-1Ra (Interleukine 1 receptor antagonist), die kan binden aan
IL-1R1 zonder dimerisatie met IL-1R3 te veroorzaken. Hierdoor wordt receptoractivatie voorkomen en
wordt intracellulaire signalisatie geblokkeerd. IL-1Ra werkt dus als een competitieve inhibitor van
IL-1β.
Een overmatige expressie van IL-1β is geassocieerd met verschillende inflammatoire aandoeningen.
Om deze reden worden IL-1β-antagonisten in de kliniek gebruikt voor de behandeling van
aandoeningen zoals reumatoïde artritis. Bovendien wordt onderzocht of het remmen van IL-1β een
rol kan spelen bij de behandeling van atherosclerose en verschillende vormen van kanker.
Gen Transcript Precursor eiwit Mature eiwit
Interleukine 1 beta 1507 bp Interleukine 1 beta Intracellulair :
proprotein gesecreteerd
IL1B 7 exonen 269 AZ 153 AZ
Chromosoom 2 CDS : 88-897 17,4 kD (Da = g/mol)
B- streng configuratie
4
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