3. Moleculaire diagnostiek
1. Analysemethoden voor nucleïnezuren: cytogenetische onderzoeksmethoden
Karyotypering = de chromosomenkaart waar alle chromosomen op gerangschikt zijn
→ Hoe bekomt men dit?
Meestal wordt het op perifere bloedmonocyten (PBMC) gedaan
→ Kan ook op beenmerg, geweekte huidfibroblasten, cellen van vruchtwater of
chorionvilli (uitsteeksels van de placenta)
Proces:
1) Er wordt 5 – 10mL bloed afgenomen in een heparine buisje
2) Er wordt fytohemagglutinine (een hormoon) aan de cellen toegevoegd
→ Gevolg: de T-lymfocyten worden gestimuleerd om te delen
3) Na 48 – 72u wordt er colchicine toegevoegd
→ Colchicine interfereert met de vorming van de spoeldraden
→ Gevolg: de celdeling wordt gestopt in de metafase (of vroeger voor een betere
resolutie (tussen profase en metafase))
4) Er wordt een hypotone oplossing aan de cellen toegevoegd
→ Gevolg: de cellen zwellen op + de individuele chromosomen worden gescheiden
5) Fixatie op een microscoopglaasje + Giemsa kleuring
→ Met een lichtmicroscoop worden de cellen bekeken
Voor routine karyotypering wordt gebruik gemaakt van een Giemsa kleuring
→ G-banding of Giemsa banding = de karakteristieke alternerende lichte en donkere bandjes van een
chromosomenpaar
➔ De donkerere bandjes:
- Bevatten relatief weinig actieve genen
- Zijn A-T rijk
- Repliceren laat in de S-fase
➔ De lichte bandjes:
- Bevatten ± 80% van de actieve genen (waaronder alle huishoudgenen)
- Zijn relatief G-C rijk
- Repliceren vroeg in de S-fase
De flow karyotypering heeft een betere resolutie
→ ➔ Chromosomen gekleurd met een fluorescerende
kleurstof passeren de laserstraal van een flow cytometer
→ De lichtverstrooiing wordt opgenomen door een
photomultiplier tube (PMT)
➔ Hoe groter het chromosoom, hoe groter het signaal
➔ Het gemiddelde van elke piek = de relatieve DNA
inhoud van een bepaald chromosomenpaar
➔ Het oppervlak onder elke piek = het relatief aantal
chromosomen in elke groep
➔ Om variatie in individuele chromosomen na te
gaan + voor identificatie van chromosoomafwijkingen
,2. Analysemethoden voor nucleïnezuren: moleculaire onderzoeksmethoden
Voor moleculaire onderzoeksmethoden moet DNA en RNA geïsoleerd worden uit materiaal van de
patiënt die wordt gebestudeerd
➔ Bij moleculaire onderzoeksmethoden zijn geen delende cellen nodig → handig!
Isolatie van mRNA:
➔ De meeste mRNA’s bezitten een poly(A)-staart aan het 3’-uiteinde
→ Dit kan men gebruiken om via een poly(T)-oligonucleotide de mRNA’s
op te vissen
---> De poly(T)-staarten worden gekoppeld op magnetische beads om
de isolatie te verbeteren
➔ mRNA wordt geïsoleerd om het expressiepatroon van 1 cel- of weefseltype
te bestuderen
→ Het transcriptoom = de volledige set mRNA van 1 cel of 1 weefseltype
➔ De bekomen pure mRNA kan gemeten worden met een spectrofotometer
of gescheiden worden met een gelelektroforese
Isolatie van RNA:
➔ Organische extractie:
Het staal wordt in een fenoloplossing gebracht en gecentrifugeerd
➔ RNA’se-vrij werken + het gebruik van RNA’se-remmers is noodzakelijk
→ RNA’se zit op onze handen en breekt RNA af
---> Daarom handschoenen dragen!
Isolatie van DNA:
Via denaturatie en extractie
→ M.b.v. zouten worden eiwitten gedenatureerd en hoogmoleculaire nucleïnezuren in
oplossing gehouden
---> Nadien wordt ijskoude ethanol toegevoegd om het DNA te doen neerslaan
---> Deze opeenvolging van stappen noemt men ‘differentiële precipitatie’
Door adsorptie op silicadeeltjes waaraan DNA blijft plakken
Door filtratie over een semi-permeabel membraan
DNA en RNA vertonen significante UV-absorptie bij 260nm
Eiwitten hebben een optimale absorptie bij 280 nm
➔ De verhouding A260nm/A280nm geeft informatie over de zuiverheid van een
nucleïnezuurpreparaat
, M.b.v. fluorescerende DNA- en RNA-kleurstoffen kan de concentratie van DNA in een oplossing
gemeten worden
➔ De meest bekende kleurstof is ethidiumbromide (EtBr)
→ Dit is kankerverwekkend en kruipt tussen DNA-moleculen
→ Alternatieve kleurstof: SYBR green
---> Dit kruipt ook tussen DNA-moleculen maar is vele veiliger dan EtBr
DNA- en RNA-moleculen kunnen d.m.v. gelelektroforese worden gescheiden
➔ Door de negatief geladen fosfaatgroepen bewegen nucleïnezuren zich bij neutrale/basische
pH in een elektrisch veld altijd naar de positieve pool
➔ De migratiesnelheid is afhankelijk van:
➢ Het type gelmatrix → agarose matrices of polyacrylamide matrices (betere resolutie)
➢ De grootte van de poriën
➢ De moleculaire afmetingen van het nucleïnezuur
➢ De conformatie van het nucleïnezuur
➔ Agarose wordt geïsoleerd uit zeewier
→ Hoe hoger de concentratie, hoe fijnmaziger het netwerk en hoe moeilijker nucleïnezuren
in de agarosegel kunnen migreren
DNA-gelelektroforese:
➔ Links: de lengtemarker
➔ Midden: DNA dat geknipt is met 3 verschillende restrictie-enzymen
➔ Rechts: controle DNA → is niet geknipt!
RNA-gelelektroforese:
➔ De 28S en 18S rRNA bandjes zijn zichtbaar
➔ Staal 1 en 2 zijn de beste stalen!
➔ gDNA = genomisch DNA
→ Als je met RNA werkt wil je geen DNA meer dus staal 5 is
een slecht staal
➔ Witte bandjes = rRNA (ribosomaal RNA)
→ De ‘smeer’ ertussen zijn allerlei lengtes van mRNA
➔ Staal 3 is een voorbeeld van gedegradeerd RNA met een RNA
smeer onder de 28S en 18S rRNA bandjes
➔ Staal 4 is een voorbeeld van RNA degradatie die resulteert in
verlies van de 28S rRNA band en een opstapeling van
gedegradeerd RNA onderaan de gel
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur nimarnatin. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €13,55. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
