Garantie de satisfaction à 100% Disponible immédiatement après paiement En ligne et en PDF Tu n'es attaché à rien
logo-home
Samenvatting Les 3 'PCR" €7,16   Ajouter au panier

Resume

Samenvatting Les 3 'PCR"

 5 vues  0 fois vendu

Dit document omvat de samenvatting (info slides + lesnotities) van les 3 van het vak 'genome technology and applications'. Les 4 was gewoon een inleiding van NGS voor de taak. Hierbij moet je in groep een presentatie geven over een bepaalde NGS techniek.

Aperçu 2 sur 11  pages

  • 7 septembre 2024
  • 11
  • 2023/2024
  • Resume
  • genetics
Tous les documents sur ce sujet (42)
avatar-seller
evagoormans
PCR
- You use two primers (20 bases long)
- They flank a sequence in between
- You denature the DNA
- Add the primers
o Begin: 3 prime end
o End: 5 prime end
- You add polymerase, bases, DNTPs, the buffer -> DNA synthesis occur
- First cycle: very long fragments
- Second cycle: you denature again, but then when the primers are add for the first Pme a
fragment of the defined length is made
- Third cycle: the final product is first seen , a fragment of the correct size ending near the end
of the primers
- MulPplying this and every cycle will double the PCR products
o If your material is very simple you don’t need to do 30 th cycles




- In the first cycles you make these very long strands with variable 3’ end, because they will
end somewhere further down the line depending on how long the reacPon is running. But
the fixed end strands with the defined length, they will starPng from the third cycle mulPply.
- From your PCR product most of it is made in the last cycles.




Start material PCR
Genomic DNA

- E.g. amplificaPon of a piece of 1.6 kb
o 1600:3.3 x 109= 1:2.000.000
o 2 million fold amplificaPon
- For 160 bp: 20 million fold amplificaPon

, cDNA: RT PCR (reverse transcriptase PCR)

- mRNA is extracted from Pssue
- Converted to cDNA via reverse transcriptase
- AmplificaPon depends on the expression level of the gene
- Genes with high expression: moderate amplificaPon level
- Genes with low expression: amplificaPon level can be extremely high

Primer design
- About 18-25 bp long
- Longer primers give a higher annealing temperature and a higher specificity
o somePmes longer at the 5 prime end because you add tags
- Annealing temperature is also determined by GC content
- primers with a lot GC have a higher annealing temperature
o Every GC base pair is 4°C and every AT base pair is 2°C
- To avoid in primer design:
o Tandem repeats
o Complementarity with known sequences can be checked using DNA databases
o Large differences in length and GC content between both primers
o Annealing temperature of the primers should be similar
o Possible hairpin structure in primer
§ Can change primer, leading to aspecific fragments
§ If there is internal complementarity the primer will fall back
o Complementarity at 2 last 3’ bases leads to primer-dimer
§ Also complementarity between the two primers should be avoided

Temperature cycles
- DenaturaPon: usually 93-95°C for human DNA
- Annealing: usually 5°C below melPng temperature primers
o MelPng temperature = temperature where 50% of the molecules is hybridised and 50%
not
o To be opPmized experimentally
- Extension: DNA synthesis
o Heat stable polymerases work most efficiently at 70-75°C
o Usually Taq DNA polymerase
§ No proofreading
• 3’ -> 5’ exonuclease acPvity
• Proofreading: A polymerase incorporates a base -> takes a step back and looks
if it is the right base -> proceed
§ Results in many incorrect bases in PCR product (mistakes)
o For some applicaPons
§ DNA polymerase with proofreading acPvity
• The proofreading that is absence in Taq can result in wrong bases in the PCR
product. If you clone some with a wrong base it can occur in a problem
• Most used is Pfu polymerase (Pyrococcus furiosus)
• Proofreading is by 3’ -> 5’ exonuclease acPvity
• Can degrade primers
§ Ohen a mix of polymerases with and without proofreading used

Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:

Qualité garantie par les avis des clients

Qualité garantie par les avis des clients

Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.

L’achat facile et rapide

L’achat facile et rapide

Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.

Focus sur l’essentiel

Focus sur l’essentiel

Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.

Foire aux questions

Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?

Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.

Garantie de remboursement : comment ça marche ?

Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.

Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?

Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur evagoormans. Stuvia facilite les paiements au vendeur.

Est-ce que j'aurai un abonnement?

Non, vous n'achetez ce résumé que pour €7,16. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.

Peut-on faire confiance à Stuvia ?

4.6 étoiles sur Google & Trustpilot (+1000 avis)

67474 résumés ont été vendus ces 30 derniers jours

Fondée en 2010, la référence pour acheter des résumés depuis déjà 14 ans

Commencez à vendre!
€7,16
  • (0)
  Ajouter