Resume
gentechnologie samenvatting
- Cours
- Gentechnologie
- Établissement
- Universiteit Gent (UGent)
gentechnologie 3de bach biowetenschappen
[Montrer plus]
Vendeur
S'abonnerAperçu du contenu
Academiejaar 2019-2020 SamenvattingGentechnologie
Laura Coene
,Inhoudsopgave
1. Inleiding .................................................................................................................................................. 4
1.1. Genoom ................................................................................................................................................ 4
1.1.1. Prokaryotische genomen ................................................................................................................ 4
1.1.2. Eukaryotische genomen .................................................................................................................. 5
1.2. Genexpressie ........................................................................................................................................ 9
1.2.1. Prokaryoten ..................................................................................................................................... 9
1.2.2. eukaryoten ...................................................................................................................................... 9
1.2.3. Genregulatie en recombinant dna (x) ........................................................................................... 10
1.2.4. Andere niveau’s genregulatie ....................................................................................................... 10
1.2.5. Eiwitlokalisatie .............................................................................................................................. 10
1.3. Basistechnieken dna-analyse ............................................................................................................. 11
1.3.1. Dna-gelelektroforese..................................................................................................................... 11
1.3.2. Restrictie-enzymen........................................................................................................................ 11
1.3.3. Sequentie analyse ......................................................................................................................... 12
1.4. Basisprincipes recombinant dna ........................................................................................................ 12
1.4.1. Principes kloning ........................................................................................................................... 12
1.4.2. genetisch gemodificeerde organismen (ggo) ................................................................................ 13
2. hybridisatie ........................................................................................................................................... 14
2.1. algemene principes hybridisatie......................................................................................................... 14
2.2. Southern of dna-gel blotting .............................................................................................................. 14
2.3. Probetechnologie, detectiemogelijkheden ......................................................................................... 15
2.3.1. Wat als probe gebruiken voor hybridisatie? ................................................................................. 15
2.3.2. Aard label en detectietechnieken na hybridisatie......................................................................... 15
2.3.3. Via welke methode label in probe inbouwen ............................................................................... 16
2.4. In situ dna hybridisatie ....................................................................................................................... 17
2.5. Koloniehybridisatie ............................................................................................................................. 17
2.6. Hybridisatie array technologie ........................................................................................................... 18
2.6.1. Dot blot en reverse dot blot .......................................................................................................... 18
2.6.2. Dna chips ....................................................................................................................................... 18
3. PCR & Q-PCR ......................................................................................................................................... 20
3.1. Basisprincipes ..................................................................................................................................... 20
3.2. Wat kan er misgaan? ......................................................................................................................... 22
3.3. Varianten ........................................................................................................................................... 23
3.4. Non-PCR-Amplificatie (isothermisch) ................................................................................................. 24
3.4.1. RNA-amplificatie = in vitro transcriptie van template ................................................................... 24
3.4.2. NASBA = Nucleic Acid Sequence Bases Amplification: isothermische cyclussen van transcriptie en
reverse transcriptie. (hier primer T7, promotor aan 5’ einde) .................................................................... 25
3.4.3. MDA = multiple displasment amplification = ‘strand displacement’ ............................................ 25
3.4.4. LAMP = Loop mediated isothermal amplification ......................................................................... 26
3.5. Quantitatief PCR = qPCR .................................................................................................................... 27
3.5.1. Real-time PCR (Q- PCR) ................................................................................................................. 27
3.5.3. Semi-Quantitatief .......................................................................................................................... 28
3.6. Voorbeelden ....................................................................................................................................... 28
4. High troughput sequenciering ............................................................................................................... 30
1
, 4.1. Next generation seq of 2de generatie seq : gebaseerd op geamplificeerd enkele molecule ............... 30
4.1.1. 454 of HT pyrosequencie............................................................................................................... 31
4.1.2. ILLUMA (SOLEXA) sequencing ....................................................................................................... 32
4.1.3. Ion proton (ion torrent)................................................................................................................. 34
4.1.4. Vergelijken verschillende methoden ............................................................................................. 35
4.2. 3de Generation sequencing ................................................................................................................. 35
4.2.1. Heliscoop ....................................................................................................................................... 35
4.2.2. Pacbio ............................................................................................................................................ 36
4.2.3. Oxford nanopore sequencing (ion sequencing) ............................................................................ 36
4.3. Toepassingen ..................................................................................................................................... 38
4.3.1. Genoom sequentie ........................................................................................................................ 38
4.3.2. RNA-Sequentie .............................................................................................................................. 38
5. Genetische variatie – polymorfisme ...................................................................................................... 39
5.1. Introductie .......................................................................................................................................... 39
5.1.1. Proteine polymorfisme.................................................................................................................. 39
5.1.2. DNA-polymorfisme ........................................................................................................................ 40
5.2. Historisch: RFLP .................................................................................................................................. 40
5.3. Hedendaagse gebruikte technieken ................................................................................................... 41
5.3.1. SNP analyse ................................................................................................................................... 41
5.4. Specifieke dna-regio’s ........................................................................................................................ 42
5.4.1. Mt-DNA ......................................................................................................................................... 42
5.4.2. rRNA .............................................................................................................................................. 42
5.4.3. Sequence repeat ........................................................................................................................... 42
5.5. Fokprogramma’s ................................................................................................................................ 43
5.5.1. Intro ............................................................................................................................................... 43
5.5.2. Identificatie specifieke eigenschap ............................................................................................... 44
5.5.3. Introgressie.................................................................................................................................... 45
5.5.4. GWAS = Genome Wide Association Studies.................................................................................. 46
5.6. Marker geassocieerde selectie of GMO/GM? .................................................................................... 46
5.6.1. Sub-gen dat rijst tollerant voor overstroming ............................................................................... 46
5.6.2. Resistentie genen van wilde Solanacae aardappel immuun tegen phytophthora ........................ 46
5.6.3. Gene pyramiding or stacking......................................................................................................... 47
5.6.4. Genetisch engineering................................................................................................................... 47
5.7. Toepassing: BUZZ groupen ................................................................................................................. 47
6. Recombinante vector ............................................................................................................................ 48
6.1. Restrictie enzyme (RE) ........................................................................................................................ 48
6.1.1. stappen .......................................................................................................................................... 49
6.1.2. Klassen RE ...................................................................................................................................... 49
6.1.3. Praktisch ........................................................................................................................................ 51
6.2. Andere enzymen voor klonering ......................................................................................................... 53
6.2.1. Dna ligase ...................................................................................................................................... 53
6.2.2. Kinase en fosfatase (Alkaline fosfatase) ........................................................................................ 54
6.2.3. Nucleasen ...................................................................................................................................... 54
6.2.4. RNA en DNA polymerase ............................................................................................................... 55
6.2.5. Reverse transcriptase .................................................................................................................... 57
6.2.6. Bacteriofaag RNA polymerase ....................................................................................................... 57
6.3. Ligatie en transformative ................................................................................................................... 58
6.3.1. Principe van cloning ...................................................................................................................... 58
6.3.2. Ligatie ............................................................................................................................................ 58
2
, 6.3.3. Transformatie ................................................................................................................................ 58
6.3.4. Controle kloning ............................................................................................................................ 59
6.4. cDNA en cDNA libraries ...................................................................................................................... 59
6.5. Genomische librarie ........................................................................................................................... 60
6.6. Analyse van kloning ........................................................................................................................... 61
6.6.1. Selectie van kolonies ..................................................................................................................... 61
6.7. Moderne kloning technieken .............................................................................................................. 62
6.7.1. Klassieke kloningsreactie ............................................................................................................... 62
6.7.2. TOPO/ TA Cloning .......................................................................................................................... 62
6.7.3. Gateway recombinate kloning ...................................................................................................... 63
6.7.4. BP reactie ...................................................................................................................................... 63
6.7.5. Isothermische kloning – Gibson assembly .................................................................................... 65
6.7.6. Golden gate cloning (TYPE IIS assembly/Modular cloning) ........................................................... 65
6.7.7. Ligatie afhankelijke cloning ........................................................................................................... 66
7. Kloning vectoren en applicaties ............................................................................................................ 67
7.1. Klonen van DNA ......................................................................................................................................... 67
7.1.1. Kloningsvectoren ........................................................................................................................... 67
7.1.2. Vector eigenschappen ................................................................................................................... 68
7.2. Expressie van vectoren ....................................................................................................................... 70
7.2.1. Prokaryoten vectoren.................................................................................................................... 70
7.2.2. Gist vectoren (YAC) ....................................................................................................................... 73
7.2.3. Insect vectoren .............................................................................................................................. 75
7.2.4. Dierlijke vectoren .......................................................................................................................... 75
7.2.5. Virale vectoren (dierlijk) ................................................................................................................ 76
7.2.6. Shuttle vectoren ............................................................................................................................ 77
7.2.7. Plant vectoren ............................................................................................................................... 78
7.3. Toepassingen ..................................................................................................................................... 78
7.3.1. Keuze van gastheer ....................................................................................................................... 78
7.3.2. Keuze van de vector ...................................................................................................................... 78
7.3.3. Transformatie ................................................................................................................................ 79
7.3.4. Toepassingen ................................................................................................................................. 79
3
,1. Inleiding
1.1. Genoom
- Functionele genoomanalyse
o Functie genen
o Expressie genen te kennen (transcriptoomanalyse)
o Producte en aanwezigheid eiwitten (proteoomanalyse) en interacties
(interacctoomanalyse)
- Genoomprojecten:
Doel = ganse sequentie genoom te bepalen
o Genoom aantal modelorganismen (kleinere genomen bv E. coli)
o Genomen micro-organismen, grotere genomen bv mens, rijst
- Bank/bibliotheek(library)
o Vroeger: collectie klones bv cDNA-bank = verzamling plasmiden met verschillend cDNA-
insert
o Genomische bank = verzameling klones stuk dna van een genoom
o Heden: collectie DNA-moleculen bv. Verzameling DNA-moleculen met adaptors om
seq-analyse te doen
- Functionele genoomanalyse
o Nadat sequentie gekend is
o Prokaryoten genen eenvoudig door ORF
o Eukaryoten moeilijk door introns, niet-coderend DNA, ESTs, comparatieve
genoomanalyse
- Genomen bestuderen typisch met modelorg:
o Snel en eenvoudig
o Genoomseq reeds gekend (bv e.coli)
o Mutanten beschikbaar
o Levensloop gekend
o Klein genoom
o Kleine levenscyclus
o Genetische modificatie mogelijk
1.1.1. Prokaryotische genomen
a) Bacterieel chromosoom
- Meestal cirkelvorming
- Ordelijk opgevouwen voor replicatie en expressie => via supercoiling en lusvorming
- E.coli
o 4600 bp; kleine plasmide
o Meeste uniek, behalve bv 7rRNA-genclusters
4
, b) Plasmiden
- Bijkomende kleine DNA cirkels onafh van het chromosoom repliceren
- Genen die nuttig zijn onder bep omstandigheden bv. Antibioticumresistentiegen
- Eigen oorsprong van replicatie = onafh chromosoom repliceren
- Sommige in chromosoom integreren = repliceren mee als episoom
- Aantal afh type
- Plasmiden zelfde incompatibiliteitsgroep niet samen in 1 cel
- Grootte van 1 kb – 250 kb
- Klein of groot gastheerspectrum
- Vaak als vectoren gebruikt in recombinant DNA
- Overgedragen via conjugate = cellen contact en plasmiden doorgeven
Voorbeelden
- Resistentieplasmiden 1 of meerdere genen antibioticum resistentie => klinische microbio =>
kunnen resistent worden via conjugatie
- Degraderende plasmiden ‘abnormaal’ chemische stoffen afbreken bv tolueen
- Virulentieplasmiden verlenen pathogeniciteit aan bacterie bv Ti-plasmide Agrobacterium
tumefaciens = tumoren op planten
1.1.2. Eukaryotische genomen
a) Grootte
- Hoeveelheid DNA in kern groter dan essentiele genen
- C-waarde paradox = eenvoudige org bv planten meer dna dan mens
- Veel niet-coderend dna tussen genen en binnen genen (introns)
- Repetitief dna in clusters of verspreid
- Nucleair dna ingepakt in chromatine en verdeeld over lineaire chromosomen
b) Chromosomen
= nucleair genoom verdeeld over aantal lineaire DNA-moleculen
- Diploïd of haploïd (bv vpltcel)
- Opgevouwen onder vorm lussen 30 nm chromatinedraad
Chromatine = comples dna opgerold rond histoneiwitten
Vorming 10 nm dikke draad => verder opgevouwd tot 30 nm draad
- Lusssen dna gebonden op nucleaire matrix
- Spiralisatie of condensatie in metafasechromosomen
c) Organelgenoom = endosymbionte theorie
- Bijkomende genomen in mitochondrien (mt) en chloroplasten (cp)
- Meeste door kern gecodeerd, in cytoplasme gesynthetiseerd en in organel geïmporteerd
- Mt codeert: rRna, mRNA, tRNA
Nucleair genoom codeert: aminoacyltRNA synthetase, ribosomale EW, RNA polymerase
- Sommige eiwitten door eigen genoom gecodeerd
- Meestal circulair
- Bevatten complete genetische systemen = voeren eigen dna-replicatie, -transcriptie en
eiwitsynthese uit (cpstrome, matrix mt)
5
, - Hogere eukaryoten
o Maternale overerving = meer cytoplasme eicel dan zaadcel
o Geen recombinantie
o Veel kopien per cel
o Kern is niet nodig (bv haar)
o 1/3 planten organellen overdragen door pollen
o Allen zelfde dna
Moleculaire merker vergelijkende analyse
d) Karakteristieke elementen eukaryotisch kerngenoom
Repititief DNA
Ingedeeld volgens kopie-aantal of volgens type
Mens:
20 % uniek dna, niet gene-relates, ‘spacer’ (funcite?)
1-1,5% coderend voor eiwitten (exons)
30% seq betrokken bij genen (introns, regulatie sequenties)
50 % repetief dna
rRna-genen
niet coderend rna (telomeren, centromeren)
‘selfisch dna’ (transpons) bv Alul
Satelliet dna = tandem herhalingen
Satelliet DNA = tandem herhaling van Dna, mogelijks afwijkend GC-gealbe bv centromeren
100 – 1000 kb clusters van ca 170 repeat; aan centromeer en telomeer
Minisatelliet = 100 bp tot 20 kb cluster van ca 5 tot 100 bp
Microsatelliet = short Tandem Repeat (STR)/simple sequence repeat (ssr): kleinere eenheid, zeer
variable
Transposons (TE)
= beweegbare DNA-elementen (jumping genes)
- Komt voor in pro en eukaryoten
- Omgekeerde herhalingen aan de uiteindes (uitz lines en sines)
- Bij eukaryoot meer variatie dan prokaryoot qua vorm en mechanisme
- Parasitair dna
- Sneller kopieën bijmaken dan er door mutatie geïnactiveerd of verwijderd worden = ‘selfish’
- Verantwoordelijk voor mutaties = ziektes, hetschikking dna
- Sommige actief bij stress-situaties => versnelde mutatie en evoluties
- Gebruikt om gemakkelijk identificeerbare mutaties te veroorzaken
6
, 1. Via dna-intermediar verspringen
- Afh type transposons via uitspringen (excisiemechanisme via transponase) elders in dna
insereert of productie kopie en dan ergens in dna springt (replicatief transposons)
- Excisiemechanisme => onstaiele mutaties
o TE insertie = gen inactiveren
o TE excisie = gen actief maken (bv pigmentvlekken op maiskorrels)
2. Retrotransposons
- Verwant aan retrovirussen (beiden LRT)
- Springen dmv RNA intermediar (LTR / non LTR)
- Niet infectieus
- Binnen eenzelfde cel vermenigvuldigen
- RNA-intermediar: eigen reverse transcriptase dna
3. Lines en Sines (=Long en Short Interspersed Sequences)
- Recombinante hotspot
- LINES = protozoa, insecten, planten, zoogdieren bv L1 (kanker) mens 50 000 kopies (6 – 7 kbp)
Coderen zelf reverse transcriptase
SINES = typisch zoogdier bv Alul (300 bp)
Transcriptase moet geleverd worden
Verschil in lengtes
- Afgeschreven via interne promotor (polIII)
RNA via reverse transcriptase DNA (kan insereren)
Multigenenfamilies
- > 100 genen
- Hogere organismen meerdere gelijkaardige genen => ontstaan genduplicatie
Genduplicatie door:
o Illegitimatie (niet homoloog) recombinantie
o Verdere evolutie ongelijke cross over (homoloog)
- Tandem kopieën evolutief stabiel = bij selectief voordeel bv rRNA : veel nodig voor voldoende
product, functie identiek = deel uitmaken ribosoom of chromatine
Sterk geconserveerd
7
, - Van elkaar wegevolueren door puntmutaties
o Verschillende functies (bv in ander celcompartiment) en structuur
o Andere regulatie (expressiepatroon)
o Verlies functie (pseudogenen)
Dna kopieert stopcodon
Proces pseudogeen : RNA re inserted in genoom via revers transcriptie
Niet coderend RNA
- Menselijk voor > 60 % afgeschreven
- 1,2% codeert voor EW
- RNA grotendeels onbekend
- Spelen rol in controle genexpressie via controle chromatinestructuur, interactie RNA-bindende
eiwitten,…
Horizontale gentransfer/ HGT/laterale gentransfer (LGT)
= proces organisme genetisch materiaal van ander org incorporeert zonder nakomeling te zijn van dat
organisme
= conjugatie vnl bij bacteriën + organellen en kern = mt genoom nucleair genoom
Bv. Transfer genen oorspronkelijk in mt genoom naar kern
- Detectie : aanwezigheid gen in soort niet aanwezig in gerelateerde soort, maar gelijkend op gen
ongerelateerde soort
- Gebeurt tss niet verwante organismen
- Eukaryote genomen kunnen dna opnemen via hgt bv Adzuki bonenkever (eukaryoot) +
endosymbiont Wolbachia (pro)
- Vaak bij samenlevende soorten
Genoom evolutie door:
- Homologe recombinanten (cross over)
- Niet homologe recombinanten (random)
o Mutatie, deletie, duplicatie, translocatie
8
, 1.2. Genexpressie
1.2.1. Prokaryoten
- Gen = ORF
- Controlesequenties niet megerekens door voorkomen
operons (genen onder controle 1 promotor)
- Promotor = eenvoudig, -35 box en TATA-box (op -10)
- Operon
o promotor door RNA-polymorase herkend om transcriptie te starten
o operator die via repressor gereguleerd wordt
o einde heeft terminator sequentie
- negatief gereguleerd :
normaal: promotor beschikbaar
geen repressor op operator gebonden = promotor beschikbaar = RNA-polymerase op
promotor
- onmiddellijk vertaald door ribosomen die Shine-Dalgarno-seq binden
zo naar AUG startcodon schuiven
translatie stopt bij stopcodon = geen overeenkomstige tRNA
1.2.2. eukaryoten
- gen = transcriptie-eenheid = codeert voor één of meerdere rna moleculen
- één gen via splicing = verschillende verwante eiwitten
- eukaryoot chromatine zorgt voor opvouwing
- positief gereguleerd = normale toestand gen inactief, geactiveerd door transcriptiefactoren =>
komt door opvouwing eukaryotisch dna = promotor niet beschikbaar = transcriptional gene
silicing (TGS)
- promotor
o complex
o basispromotor en enchancermodules
o mRNA afgeknipt stroomafwaarts poly-adenylatieplaats (3’ polyA-saart aan mRNA) + 5’
kammpje
- introns via splicing weg uit primair transcript
- translatie
o 5’ kap herkennen
o Kozak seq = bevat AUG
o Leest tot stopcodon
9
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur lauratjn_. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €3,99. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
Peut-on faire confiance à Stuvia ?
4.6 étoiles sur Google & Trustpilot (+1000 avis)
50155 résumés ont été vendus ces 30 derniers jours
Fondée en 2010, la référence pour acheter des résumés depuis déjà 14 ans