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Summary Zelfstudie: gateway cloning & gibson assembly - Genome technology and applications

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samenvatting van de zelfstudie gateway cloning & gibson assembly voor het vak Genome technology and applications in het Engels.

Aperçu 2 sur 15  pages

  • 13 septembre 2024
  • 15
  • 2024/2025
  • Resume
Tous les documents sur ce sujet (41)
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paulienmeulemeester
Gateway cloning
Genome technology and applications


Explenation
 A technique used to clone a gene of interest into a variety of expression systems

 In vitro version of the integration and excision recombination reactions that take
place when lambda phages infects bacteria

 In vivo: this reaction is done by recombination of attachment sites from the phage
(attP) and the bacteria (attB)  the phage integrates into bacterial genome flanked
by new recombination sites (attL & attR)




 attL & attR can recombine  excision of phage from bacterial chromosome &
regeneration attP & attB

 Gateway vector: contains modified version of the att sites

Gateway Technology relies on 2 reactions

BP Reaction
- Between attB sites (flanking insert) and attP sites (of donor vector)
- Reaction catalyzed by BP clonase enzyme mix
- Generates entery clone  containing DNA of interest flanked by attL
- As byproduct: ccdB is excised from donor vector

, = rate limiting step  formation of protein-DNA complex
Each single unit of enzyme binds to one side of one recognition site  forming dimer on
each att site
The 3D conformation is different on the 2 different sites  allows them to properly pair
2 dimers come together forming a complex




2. a serine residue at active side of each monomer attack the P-backbone of the DNA within
the central region  results in creation of sticky end of DNA as well as a covalent bond
between protein and DNA backbone  at this point the 3D conformation of the complex
changes  the stands swap at the sticky ends
3. the enzyme relegates the backbones back together, the DNA is no longer covalent
attached to the enzyme  free to leave and repeat reaction




LR reaction

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