Resume
Samenvatting H3: analyse van RNA
- Établissement
- Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Heel gedetailleerde samenvatting van de powerpoint en aantekeningen. Ook eigen notities toegevoegd om het duidelijker te maken.
[Montrer plus]
Vendeur
S'abonner
Aperçu du contenu
Hoofdstuk 3 – RNAInleiding
Wat is er verschillend tussen DNA en RNA?
- DNA = T RNA = U
(men denkt dat DNA het oudst is: er bestaat DNA dat U bevat i.p.v. T in zeldzame
organismen over de tijd: U naar T geëvolueerd OMDAT T het DNA stabieler maakt
tegen mutaties)
- Suikerstructuur
DNA = deoxyribonucleïnezuur (geen OH op 2’)
RNA = ribonucleïnezuur (wel OH op 2’)
maakt RNA veel meer vatbaar voor afbraak door RNAsen: extra OH op 2’ maakt
dat RNA veel instabieler is (2’OH is meer vrij om te reageren)
Je moet oppassen: RNA kan in onze handen afbreken als we er mee werken
DNA = super stabiel
Herinner: dideoxyribonucleïnezuur = geen OH op 2’ en op 3’
= belangrijk bij Sanger sequencing: bouwen we in DNA in zodat we geen
ketenverlenging meer krijgen want 3’ OH vormt fosfodiësterverbindingen
- DNA = meestal dubbelstrengs RNA = meestal enkelstrengs
! let op: daar zijn uitzonderingen op
- RNA = kan secundaire of tertiaire structuur hebben
= 2D opgevouwen of 3D opgevouwen
Deze verschillen bepalen dat we methoden van DNA moeten aanpassen als we met RNA
willen werken…
Typisch: DNA codeert voor RNA RNA codeert voor eiwitten
Soorten RNA:
, rRNA = in ribosomen = 80-95% van totale RNA in cel (18S en 28S) betrokken in translatie
tRNA = vertaald genetische informatie i/h mRNA naar AZ betrokken in translatie
mRNA = vertaling van DNA naar eiwitten: boodschapper RNA = 1-4% van totale RNA
in cel
rRNA en tRNA = (housekeeping) niet-coderend RNA mRNA = coderend RNA
MAAR er zijn nog andere categorieën van RNA dan RNA dat codeert voor eiwitten…
Andere categorieën van RNA die niet tot eiwit worden omgezet = functie enkel als RNA:
korte niet-coderende RNA’s (< 200 nt)
microRNA (1000’en gekend + spelen rol bij ziekte) = helpen TXN reguleren
= genen aan- en uitzetten om genexpressie te regelen
small interfering RNA (siRNA) = cellen moduleren in onderzoek
lange niet-coderende RNA’s (> 200 nt)
long non coding RNA’s (heel veel ontdekt + spelen rol bij ziekte) = helpen TXN
reguleren = genen aan- en uitzetten om genexpressie te regelen
kort en lang niet-coderende RNA = (regulatory) niet-coderend DNA
Structuur mRNA
Pre-mRNA wordt gespliced = intronen eruit geknipt tot matuur mRNA
Pre-mRNA = heel vluchtig (bestaat niet lang: instabiel) we werken met matuur mRNA
coderende regio = deel dat vertaald wordt naar eiwit
5’ UTR & 3’ UTR = deel van mRNA dat niet mee omgezet wordt in eiwit
= regulerende functie
5’ cap = modificatie op 5’ = gemodificeerde G-groep (niet omgezet naar eiwit)
3’ poly-A staart = tot 200 x een herhaling van A (niet omgezet naar eiwit)
Splicing = splitsen en lassen = ‘aan elkaar lassen van de exonen’ en ‘intronen er uit knippen’
, 5’ cap = guanine gemethyleerd op
plaats 7
= geheel herkent door ribosomen
2.3.1 RNA voorzorgen en bewaren
RNA = super fragiel we moeten oppassen!
Mogelijke problemen:
- RNA-profiel kan na staalname heel snel veranderen ( DNA blijft redelijk stabiel)
indien we weefsel of bloedstaal nemen en geen voorzorgen nemen: vervoeren zo
op kamertemperatuur vanuit ziekenhuis naar labo, dan kan dat expressieprofiel van
RNA al veranderen bijvoorbeeld: cellen gaan bepaalde genen aanzetten inductie genen
& extra RNA aanmaken & andere RNA-moleculen worden afgebroken
= wat we meten ≠ representatief met wat effectief in patiënt aanwezig was
- RNA afbraak/degradatie door endo- of exogene RNAsen = zitten overal (huid, lucht…)
geen voorzorgen: RNA volledig afgebroken voor we er goed en wel mee van start
kunnen gaan om te analyseren
- DNA contaminatie: scheiding DNA/RNA volledig krijgen ≠ gemakkelijk
bij DNA: gemakkelijk DNA/RNA scheiden want RNAsen breken RNA heel vlot af
waardoor DNA RNA-vrij wordt
Endogene RNAsen = RNAsen in staal
Exogene RNAsen = RNAsen van buitenaf
STAALNAME
- Verschillende tubes om bloedstaal af te nemen
- We moeten werken met anticoagulans/antistollingsmiddel, anders is bloed reeds
volledig gestold ≠ bruikbaar om met DNA of RNA verder te werken
Keuze: EDTA = beste antistollingsmiddel voor alles wat DNA of RNA is
heparine interfereert met of inhibeert DNA/RNA reacties
- RNA stabilisatie: RNA mag niet afgebroken worden maar ook niet extra gaan
veranderen (= extra inductie van bepaalde genen) RNA degradatie en/of inductie voorkomen
Zo snel mogelijk staal verwerken of invriezen in vloeibaar N (-196°C)
Totaal bloed in vacuümtube met RNA-bewaarmiddel bv. PAXgene tube
Hulpmiddelen om RNA te stabiliseren: RNA bewaarmiddel
bv. RNAlater voor extractie = ammonium sulfaat oplossing - gaat eiwitten neerslaan &
vermits RNAsen = eiwitten, ook RNAsen kunnen RNA niet meer afbreken als ze geprecipiteerd zijn
+ extra genen kunnen er ook niet op gereguleerd worden
Bv. Trizol eerste stap van extractie
, = RNA bewaarmiddel toevoegen om RNA meteen te stabiliseren
Staal kan wel bewaard worden op kamertemperatuur voor een dag of week d.m.v. RNA
bewaarmiddelen: staal ≠ kritiek
STAALVERWERKING: RNAse-vrij werken!!!
- Zeer zuiver werken
- Labojas + handschoenen = stalen beschermen tegen RNAsen die bv. op huid zitten
- Afgebakende werkzone voor RNA-werk
- Oppervlakken, pipetten… schoonmaken met RNAase schoonmaakproduct (bevat
juist wel RNAsen)
= eerst alles mee schoonmaken zodat geen RNA en RNAsen meer aanwezig zijn
- RNAase vrije filter-pipettips en plastics
- Nuclease-vrije oplossingen & nuclease-vrij water:
gefilterd water (Milli-Q) of RT-PCR grade water (= water getest op afwezigheid
van RNAsen)
oplossingen zelf behandelen met RNAse inhibitoren
bv. DEPC = reageert met amines vnl. histidine in AZ i/d katalytische site van RNAsen –
RNAsen inhiberen TRIS = ook een amine (in TRIS-buffer): DEPC werkt niet in
TRIS-buffer, wel in water
Nadeel: carcinogeen
nieuwere RNAse inhibitoren (minder carcinogeen)
RNA-STAAL BEWAREN: (RNA = zeer fragiel)
- in RNAse-vrij water (of TE-buffer, maar EDTA inhibeert RNAsen niet DNA: EDTA
inhibeert DNAsen wel)
- bewaring op -80° tot 1 jaar ( bewaart minder lang dan DNA!)
- langere bewaring eventueel als alcoholprecipitaat
- beter: meerdere aliquots (= meerdere kleine hvh van staal bewaren) in RNA
bewaarmiddel enkel RNA extraheren dat nodig is en andere stalen goed
ingevroren bewaren voor latere RNA extractie…
DNA CONTAMINATIE:
- ≠ altijd probleem bv. niet wanneer toepassing onderscheid maakt tussen DNA/RNA
- Hoe detecteren?
RT-min controle = reverse transcriptase weglaten (zie later)
Elektroforese (zie later)
- Als we vaststellen dat er toch nog DNA bij RNA zit…
DNA verwijderen door DNAse toe te voegen
Tijdens RNA-extractie toevoegen of bij behandeling van al geëxtraheerd RNA dus
na RNA-extractie vaak pas later gedaan: gaat niet alleen DNA afbreken maar
ook vaak RNA beschadigen: alleen toepassen als nodig is
Bv. DNAse 1 knipt dsDNA en ssDNA
Bv. dsDNA-specifieke DNAsen
DNA extraheren: standaard RNAsen toevoegen
DNAse inactiveren door verhitten of DNAse verwijderen na behandeling
Nadeel: verlies of degradatie van RNA mogelijk
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur emmavandooren1. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €7,16. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
Peut-on faire confiance à Stuvia ?
4.6 étoiles sur Google & Trustpilot (+1000 avis)
52510 résumés ont été vendus ces 30 derniers jours
Fondée en 2010, la référence pour acheter des résumés depuis déjà 14 ans