Resume

Samenvatting H1-H2 - Biotechnologie III

0 fois vendu

Cours
Biotechnologie III

Établissement
Odisee Hogeschool (Odisee)

Dit is een zeer uitgebreide samenvatting van de hoofdstukken 1 en 2 bij het vak biotechnologie III. Deze is gemaakt aan de hand van de slidesets en het handboek.

[Montrer plus]

Aperçu 4 sur 53 pages

Voir l'exemple

Publié le 6 janvier 2025
Nombre de pages 53
Écrit en 2024/2025
Type Resume

blt
fbt
biotechnologie iii
odisee
samenvatting

€7,16

Ajouter au panier

Enregistrer

Garantie de satisfaction à 100%
Disponible immédiatement après paiement
En ligne et en PDF
Tu n'es attaché à rien

Biotechnologie III
1. Vectoren & kloneringen
1.1. Inleiding
Klonen= aseksueel replicatie van een organismen om genetisch identiek dezelfde organismen te
bekomen
 Uitbreiding:
Klonen gaat ook over een gen of gen fragmenten, niet alleen geheel organisme
= kloneren  een vreemd gen/gen fragment binnen brengen in een bacterie, zodat die het
gen mee verder kopieert
Toepassingen:
 Sequenering van het gen
 Aanmaken van een probe voor expressiescreening
 Expresseren van het gen in de gastheercel. Uitkomst= grote hoeveelheid eiwitproduct
bekomen
 Mutatie van het gen . Uitkomst= veranderde functie van het eiwit bekomen
 Recombinante vector bekomen. Uitkomst= hoger orde organisme transgeen maken

2 benaderingswijzen:
1) Cel gebaseerde DNA-klonering
Gewenste fragment in vivo selectief amplificeren
3 essentiële stappen:
1. Keuze van de geschikte bron van het te kloneren DNA
2. Aanleggen van DNA-fragmenten dat in een gastheer/vector kunnen
geïntroduceerd worden
3. Screenen van de bekomen kolonies voor de aanwezigheid van de gewenste DNA
sequentie
=> Alle bacteriën in dezelfde kolonie bevatten dezelfde plasmiden
2) In vitro DNA-klonering
Gewenste fragment in vitro selectief amplificeren

In vitro versus in vivo
 In vitro= in glas, experimenteren buiten een levend organisme in een beschermde omgeving
 In vivo= in levende, experimenten binnen een levend organisme

1.2. Ligatie
1.2.1. Inleiding
Ligatie= de verbinding tussen de vector en het gen van interesse
Door: enzym DNA ligase
 Nicks (=Enkelstrengige breuken) in DNA herstellen
 Verbindt de 3’ OH groep met de 5’ fosfaatgroep
 Hersteld zowel sticky ends als blunt ends
Uitzonderlijke DNA ligases:
- E. coli DNA ligase  enkel sticky ends verbinden

1

, - T4 DNA liagse  beide maar niet efficiënt voor blut ends
 Vereist ATP (cosubstraat)
 Functie: nicks repareren
 Reactie:
1. Ligase reageert met ATP= covalent enzyme-AMP complex
2. Covalent enzyme-AMP complex reageert met het 5’-fosfaat van het DNA +
AMP wordt overgedragen aan de fosfaat groep
3. 3’OH reageert met het gevormde complex
= covalente foso-diësterverbinding + AMP vrijgesteld
Opletten:
5’fosfaat is noodzakelijk. Als deze afwezig is (kan door fosfatase)= zal het niet werken
=> Fosfatase kan gebruikt worden om zelfsluiting te verhinderen
Ligase heeft nodig:
 DNA
 Mg2+
 Buffer
 ATP
 T4ligase
Reactie= overnacht

1.2.2. Optimalisatie van ligatie-condities
Succes ligatie= verwijst naar de efficiëntie/succes van een ligatiereactie
 Hoeveel fosfo-diësterverbindingen heb ik kunnen vormen
Belangrijk maar onvoorspelbaar
Factoren die succes ligatie verminderen:
- Aanwezigheid van inhibitoren
- Degradatie van het enzym of DNA
- Niet optimale reactie omstandigheden  optimalisatie nodig

Product ligatie= verwijst naar het resultaat van een ligatiereactie
 Hoeveel verschillende producten heb ik nu eigenlijk gevormd

1) Monomoleculaire reactie
= concentratie onafhankelijk
2) Bimoleculaire reactie of intermoleculaire reactie
= de verbinding tussen 2 of meerdere verschillende DNA moleculen
 Vector – insert
3) Intramoleculaire ligatie= de verbinding binnen hetzelfde DNA molecule
 Vector – vector of insert – insert
 Concentratie verhogen van vector, niet van insert= meer kans op
intramoleculaire vector – vector reactie
=> Willen we niet
 Concentratie verhogen van insert, niet van vector= meer kans op
intramoleculaire insert – insert reactie
=> Willen we ook niet, maar minder probleem
Optimale concentratie vector tot insert= 1:3 tot 3:1 voor sticky end
Optimale concentratie vector tot insert= 1:5 voor blunt ends
2 & 3= concentratie afhankelijk  werken met hoge concentraties

2

,Molaire ratio berekenen:
(Wv / Sv) : (Wi / Si)
 Wv= gewicht vector (ng)
 Sv= grootte vector (bp)
 Wi= gewicht insert (ng)
 Si= grootte insert (bp)
Oriëntatie van het insert is ook belangrijk => niet gecontroleerd

1.2.3. Voorkomen van ongewenste ligatie: alkalische fosfatase en
dubbeldigeste
2 andere methoden om ongewenste ligatie te voorkomen:
- 5’fosfaatgroep verwijderen van de vector  zelfsluiting vermijden
- Toepassen van een dubbele restrictie-digest
1.2.3.1. Defosforylatie van de vector
Verwijderen van 5’fosfaat van DNA, RNA, ribo- en deoxyribonucleosidetrifosfaten door:
- BAP= bacterieel alkalisch fosfatase
- CIP= kalf intestinaal fosfatase
= zelfsluiting van de vector wordt onmogelijk
 Ligatie met een insert wel nog, insert heeft zijn 5’ fosfaat nog
Verwijderen van fosfaat VOOR DE LIGATIE
 Anders verliest het insert ook zijn 5’fosfaatgroep
 In-activatie van het fosfatase= onbetrouwbaar
Dus:
- DNA uit het mengsel halen door:
 Anionuitwisselingschromatografie
 Fenolextractie gevolgd door een ethanolprecipitatie
Na de ligatie:
 Ligatieproduct met 2 nicks= geen probleem
Blijft stabiel door de waterstofbruggen van de basenparing
 Wanneer het plasmide getransformeerd wordt, hersteld de bacterie deze nicks bij de
dochtercellen tijdens de replicatie
(Toevoegen van de ontbrekende fosfatasen)
= plasmide wordt vermenigvuldigd in een volledig intacte vorm
1.2.3.2. Defosforylatie van het insert
Bij een heterogeen insert pool (= genomische bank)
 Defosforyleren van het insert in plaats van de vector
Ook met :
- BAP
- CIP
= geen multimeren van de inserts kunnen gevormd worden
Multimeren van de inserts= zijn DNA-fragmenten die in meerdere kopieën in een vector zijn
ingebracht tijdens een kloneringsproces

Wel: zelfsluiting van de vector mogelijk
 Vermijden door:
Vectoren te gebruiken die enkel tot succesvol getransformeerde bacteriën kunnen leiden

3

, 1.2.3.3. Dubbele restrictie-digest
 De 2 elementen voor de ligatie telkens met 2 restrictie-enzymen laten knippen
= ontstaan van niet-compatibele sticky ends
 Vaan in MCS= Multiple Cloning Site
Waarom daar?
=> Er is niets van belang aanwezig
Extra stap nodig voor de kloenring met vector?
=> Kleine stukje en de rest van de vector moeten gescheiden worden van elkaar door
preparatieve gel elektroforese
Voordelen:
- De oriëntatie van het insert blijft gecontroleerd tijdens de ligatie
- Zelfsluiting van de vector voorkomen
- Insertie van multimere inserts voorkomen

1.3. Modificatie van DNA uiteinden
Modificatie= het aanpassen van de DNA uiteinden via restrictie-enzymen
Restrictie enzymen kunnen:
- 5’ overhangende ends creëren
- 3’ overhangende ends creëren

1.3.1. Conversie van 3’-uitstekende eindjes tot even eindjes (blut ends)
 Verwijderen of opvullen tot een stomp einde
Door: T4 polymerase of klenow fragment (= afgeleid enzym van DNA-polymerase I)
- 5’  3’ polymerase activiteit
Synthetiseert nucleotiden
- 3’  5’ exonuclease activiteit
Uitstekende nucleotiden worden verwijderd
- Trifosfaten verhinderd een overdreven exonuclease activiteit
- Enzym heef nodig voor de werking:

4

Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:

Qualité garantie par les avis des clients

Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.

L’achat facile et rapide

Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.

Focus sur l’essentiel

Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.

Foire aux questions

Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?

Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.

Garantie de remboursement : comment ça marche ?

Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.

Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?

Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur nettedevisscher. Stuvia facilite les paiements au vendeur.

Est-ce que j'aurai un abonnement?

Non, vous n'achetez ce résumé que pour €7,16. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.

Peut-on faire confiance à Stuvia ?

4.6 étoiles sur Google & Trustpilot (+1000 avis)

66184 résumés ont été vendus ces 30 derniers jours

Fondée en 2010, la référence pour acheter des résumés depuis déjà 15 ans

Commencez à vendre!