Methoden 3
INHOUD
1. Inleiding ............................................................................................................................................................. 4
2. Analyse van DNA en genomics .......................................................................................................................... 4
2.1. DNA sequentiebepaling ................................................................................................................................ 4
2.1.1. 1ste generatie sequentiebepaling .......................................................................................................... 5
2.1.2. 2de generatie sequentiebepaling ........................................................................................................... 7
2.1.3. 3de generatie sequentiebepaling: long-read next-generation sequencing ......................................... 15
2.1.4. Epigenetica sequentiebepaling (methylatie sequentiebepaling) ........................................................ 18
2.1.5. Single-cell sequentiebepaling.............................................................................................................. 20
2.2. DNA genotyperen ....................................................................................................................................... 21
2.2.1. Short-tandem repeat (STR) genotypering ........................................................................................... 22
2.2.2. Taqman genotypering ......................................................................................................................... 22
2.2.3. Microarrays (+ genoomwijde associatiestudies) ................................................................................. 23
2.3. DNA hybridiseren ....................................................................................................................................... 25
2.3.1. FISH ..................................................................................................................................................... 25
2.3.2. CGH ..................................................................................................................................................... 26
2.3.3. SNP micro-arrays toegepast op CNV’s ................................................................................................ 26
3. Analyse van RNA en transcriptomics ............................................................................................................... 28
3.1. RNA micro-ARRAYS..................................................................................................................................... 28
3.1.1. Voorbeelden ........................................................................................................................................ 31
3.2. RNA sequencing (bulk) ............................................................................................................................... 31
3.2.1. short-read RNA (cDNA) sequencing .................................................................................................... 32
3.2.2. long-read cDNA en direct RNA sequencing ......................................................................................... 34
3.3. Single-cell RNA sequencing ........................................................................................................................ 34
3.3.1. Droplet sequencing ............................................................................................................................. 34
3.3.2. CITE-seq ............................................................................................................................................... 35
3.4. Spatial transcriptomics ............................................................................................................................... 36
4. Analyse van eiwitten en proteomics ............................................................................................................... 40
4.1. Sequentiebepaling ..................................................................................................................................... 40
4.1.1. Edman degradatie ............................................................................................................................... 40
4.1.2. Eiwit sequentie bepaling via massa spectrometrie ............................................................................. 40
4.2. Proteoom analyse ...................................................................................................................................... 41
4.2.1. Bulk analyse......................................................................................................................................... 41
4.2.2. Single cell proteomics ......................................................................................................................... 45
4.2.3. Spatial proteomics............................................................................................................................... 46
4.3. 3D structuur bepaling................................................................................................................................. 48
4.3.1. X-straaldiffreactie en kristallografie............................................................................................ 48
4.3.2. NMR spectroscopie ............................................................................................................................. 52
1
, 4.3.3. Cryo-elektronenmicroscopie – Cryo-EM ............................................................................................. 52
4.3.4. Overzicht van methodes voor eiwitstructuur ..................................................................................... 53
4.4. Eiwit-eiwit interacties................................................................................................................................. 53
4.4.1. Yeast-2-hybrid en mammalian 2-hybrid ............................................................................................ 53
4.4.2. Affinity pull-down .............................................................................................................................. 55
4.4.3. Co-immunoprecipitatie (co-IP) .......................................................................................................... 55
4.4.4. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) & Bioluminiscence Resonance Energy Transfer
(BRET) ............................................................................................................................................................ 56
4.4.5. Bindingsarrays ................................................................................................................................... 57
4.4.6. Surface plasmon resonance .............................................................................................................. 57
4.4.7. Phage display ...................................................................................................................................... 58
4.4.8. Proximity Ligation Assay (PLA) ........................................................................................................... 58
4.4.9. RIME ................................................................................................................................................... 59
4.4.10. Ligand-receptor bindingsstudies ....................................................................................................... 60
5. Analyse van metabolieten en lipiden .............................................................................................................. 62
5.1. Specifieke testen van individuele metabolieten ........................................................................................ 62
5.2. Metabolomics ............................................................................................................................................ 62
5.2.1. Via NMR-spectroscopie ....................................................................................................................... 63
5.2.2. Via MassaSpectrometrie ..................................................................................................................... 63
5.3. Metabole flux analyse ................................................................................................................................ 64
5.3.1. Stable isotope-resolved metabolomics (SIRM) /Tracer metabolomics (via NMR of MS) ................... 64
5.3.2. Metabolic flux analyzer (Seahorse) ..................................................................................................... 65
5.4. Analyse van lipiden..................................................................................................................................... 66
5.4.1. Extractie van LIPIDEN .......................................................................................................................... 66
5.4.2. Thin layer chromatografie - TLC / high performance TLC / 2D-TLC ..................................................... 67
5.4.3. High performance liquid chromatografie - HPLC ................................................................................ 67
5.4.4. Gaschromatografie - GC ...................................................................................................................... 68
5.4.5. MS-based lipidomics ........................................................................................................................... 68
5.4.6. Spatial lipidomics ................................................................................................................................ 71
6. Analyse van gentranscriptie ............................................................................................................................ 74
6.1. Nascent RNA analyses ................................................................................................................................ 74
6.1.1. Run on ASSAYS .................................................................................................................................... 74
6.1.2. Andere nascent RNA analyse methoden ............................................................................................. 75
6.1.3. Imaging-gebaseerde nascent RNA analyse methoden ........................................................................ 76
6.2. Promoter-reporter studies ......................................................................................................................... 77
6.3. Analyse van protein-DNA interacties ......................................................................................................... 77
6.3.1. DNase footprinting .............................................................................................................................. 77
6.3.2. EMSA ................................................................................................................................................... 78
6.3.3. Open chromatine ASSAYS ................................................................................................................... 79
6.3.4. Chromatine immunoprecipitatie ASSAYS ............................................................................................ 80
7. Databanken en data-analyse ........................................................................................................................... 82
2
, 7.1. Databanken ................................................................................................................................................ 82
7.1.1. Literatuur ............................................................................................................................................ 82
7.1.2. Data repositoria .................................................................................................................................. 82
7.1.3. Data platformen .................................................................................................................................. 83
7.2. Data analyse ............................................................................................................................................... 84
7.2.1. Annotatie van genlijsten ..................................................................................................................... 84
7.2.2. Interactienetwerken............................................................................................................................ 85
7.2.3. Structuuranalyse van biomoleculen .................................................................................................... 85
8. Modulatie van genexpressie ........................................................................................................................... 86
8.1. Onderdrukking van genexpressie via antisense technologie ..................................................................... 86
8.1.1. Antisense oligonucleotiden (ASO) .............................................................................................. 86
8.1.2. RNA interference (RNAi) ............................................................................................................. 87
8.2. Gendisruptie, mutagenese en editing ........................................................................................................ 89
8.2.1. Transposons ................................................................................................................................ 89
8.2.2. Site specific DNA recombinatie ................................................................................................... 92
8.2.3. Mutagenese ................................................................................................................................ 94
8.2.4. CRISPR ......................................................................................................................................... 94
8.3. Ectopische expressie en overexpressie .................................................................................................... 100
8.3.1. Directe injectie van mRNA ........................................................................................................ 100
8.3.2. DNA vectoren .................................................................................................................................... 100
8.4. Gerichte proteïne degradatie ................................................................................................................... 103
8.4.1. Conditionele degrons ................................................................................................................ 103
8.4.2. Bifunctionele moleculen: PROTACs .......................................................................................... 104
8.4.3. TRIM away ........................................................................................................................................ 105
8.5. Methoden van gentransfer ...................................................................................................................... 106
8.5.1. Transfectie ................................................................................................................................ 106
8.5.2. Transductie ............................................................................................................................... 108
9. Inleiding tot systeembiologie en synthetische biologie ................................................................................ 112
9.1. Systeembiologie ....................................................................................................................................... 112
9.2. Synthetische biologie ............................................................................................................................... 112
10. Integreren van methoden en oplossen van concrete biomedische vraagstellingen .................................... 113
10.1. Voorbeeld 1 ............................................................................................................................................ 113
10.2. Voorbeeld 2 ............................................................................................................................................ 115
10.3. Voorbeeld 3 ............................................................................................................................................ 116
10.4 Voorbeeld 4 ............................................................................................................................................. 117
10.5. Voorbeeld 5 ............................................................................................................................................ 118
3
,1. INLEIDING
Belang van methoden
Grote verscheidenheid vraagstellingen waarbij het antwoord afhankelijk is van de methoden die we beschikbaar
hebben/gebruiken
→ Methoden in Biomedisch onderzoek zijn essentieel voor medische vooruitgang
2. ANALYSE VAN DNA EN GENOMICS
2.1. DNA SEQUENTIEBEPALING
Eerste generatie - 1977
- Sanger, (Maxam & Gilbert)
- Goedkoper dan NGS ter controle van constructen in labo context
- Humaan genoom project, 1 euro per base, 10 jaar durend project, 1990-2003
Tweede generatie - 2006
- ‘Next Generation Sequencing’ (NGS)
- Massief parallel sequencen van clonaal in vitro geamplificeerde DNA moleculen
- Goedkoper en sneller
- Minder mensen en minder machines
- Illumina, Ion Torrent
Derde generatie - 2010
- ‘Next-next Generation Sequencing’
- Sequencing van individuele DNA moleculen (geen amplificatie nodig)
- Nog sneller, nog minder mensen, nog goedkoper
- Zeer groot en belangrijk voor de nieuwe diagnostiek
- Nanopore, Pacific Biosciences
Brede toepassingen
De novo
Genoomsequentie is nog niet gekend, onbekende genomen
Nieuwe bacterie voor de allereerste keer sequencen
Overlappende stukken nodig om zo tot totaal genoom te komen om puzzel te kunnen leggen
Moeilijker aangezien er veel repetitieve sequenties aanwezig zijn (uitdaging)
Resequencing
Referentiegenoom beschikbaar ter vergelijking met wat we zelf sequencen
Individuen t.o.v. referentie genoom
Verschillen tussen mensen wel aanwezig SNP (3 miljoen verschil op 3 miljard)
Makkelijker om puzzel te leggen, sequentie mappen op referentiegenoom
Toepassingen Klinisch: NIPT, BRCA → diagnose
Farmacogenetica: dubbel, door individuele reactie en SNP’s kan iedereen anders reageren op
medicijn en zo soms sterfgevallen
Sequentie als telling
Typische bij transcriptomics
Aantallen DNA (of RNA) moleculen
RNA naar cDNA, deze sequencen en kijken hoe vaak transcript voorkomt en bepaalde sequentie kunnen gaan
tellen
Vb RNA Seq en ChIP Seq
4
, Figuur 1: De novo versus resequencing
Whole genome, exome en targeted sequencing
WGS Whole-genome sequencing
WES Whole-exome sequencing
= coderende sequentie
= 1.5% van genoom
Targeted sequencing Specifieke gewenste regio’s
Transcriptoom RNA → cDNA
Als er fout is bij een bepaald eiwit dan kan men beter enkel het gen gaan sequencen in plaats van het volledige
genoom
2.1.1. 1 S T E GENERATIE SEQUENTIEBEPALING
Twee methoden Maxam en Gilbert (1977)
Sanger (1980)
Maxam en Gilbert
= chemische klieving methode
Niet meer gebruikt, historisch
Principe:
- Differentiële chemische klieving van nucleïnezuren in 4 verschillende reacties, gevolgd door scheiding
volgens grootte op gel en visualisatie via autoradiografie
- Radio-actief merken: dsDNA gaan merken met radioactief materiaal, P-groep op het einde is radioactief
gemaakt, een van de 2 labels weggooien door restrictie enzym→ zo dsDNA met 1 streng gemerkt,
daardoor maar 1 streng gevisualiseerd
- Chemisch afbreken door te scheiden in 4 verschillende buisjes en met reagens chemische stof die breuk
veroorzaakt na G, A+G, C+T, C, voldoende info om sequentie te kunnen bepalen, op gel, korte
fragmenten zijn het snelst zichtbaar, van beneden naar boven sequentie aflezen
5
, Nadelen Voordelen
Relatief korte fragmenten Niet beschreven in cursus
Niet helemaal specifiek
→ sequentie niet altijd éénduidig (interferentie)
Sanger
= nieuwsynthese met dideoxy-keten terminatie
Principe:
- Start met clone of PCR amplicon (vb. van genomisch DNA fragment)
- Polymerase met primer en mengsel van 4 gekende dNTPs en kleine fractie ddNTPs = nieuwsynthese
ddNTPs: 3’OH groep ontbreekt waardoor er geen fosfodiesterbinding kan gevormd worden voor
verlenging van de DNA keten
- Reactie loopt door na inbouwen van een dNTP maar keten stop na inbouwen van ddNTPs
- Juister verhouding van dNTPs en ddNTPs
- Volgens de lengte scheiden bij capillaire elektroforese, met laser kleur detecteren en sequentie
automatisch afgelezen, chromatogram (elektroferogram)
- Voor betrouwbaarheid vaak FW en RV primer voor beide richtingen te lezen
Nadelen Voordelen
Beperkt tot 500 nt Niet beschreven in cursus
Moeite met repetitieve regio’s
Elektroferogram aflezen
1ste tot 30ste basenpaar is niet echt afleesbaar
Meestal 500 tot max 700 bp voor goede afleesbare sequentie
Software aan de hand van Phred score
Phred score= accuraatheid van de base-calling, score van 10 betekent dat 1 op de 10 fout is
Voorkeur voor een phred score van 30, zekerheid dat 1 op 1000 base mogelijks fout is
Beperkingen Piek van mutant valt dubbel, soms pieken niet altijd even duidelijk, verschil tussen sequentie
fout versus mutatie
→ forward en reversed reacties ter bevestiging
Verwezenlijkingen met 1ste generatie sequencing
Human Genome Project - HGP
= de novo sequencing project voor het humane genoom
1990-2003, kost: 3 miljard dollar
Humaan genoom: meerdere anoniemen individuen, mengsel van verschillende personen
Methode Hierarchical shotgun sequencing met Sanger methode clones in YACs, BACs, P1s, cosmiden
Mapping en fragmentatie (5 jaar)
Automatische staal bereiding en sequentiebepaling door 20 centra over de hele wereld (100-
den toestellen)
Elke 24 uur publieke vrijgave van sequenties
Draf-sequentie klaar in 2001, finale sequentie klaar in 2003, vandaag de dag gebruikt in databanken maar nog
altijd niet finaal door moeilijk te kloneren sequenties
Craig Venter
= project voor sequencing van het humane genoom tegelijk met HGP
Humaan genoom: 5 individuen waaronder Craig Venter zelf
Methode Whole genome shotgun sequencing (random clones, geen mapping)
330 toestellen volgens Sanger
Toevallig ook een draft sequentie in 2001
Competitie met HGP
6
