ALGEMENE EN MOLECULAIRE GENETICA
HOOFDSTUK 11 IDENTIFICATIE VAN ZIEKTEVEROOZAKENDE GENEN
11.1 Inleiding
- Kijken op welke manier ziekteveroorzakende genen bij de mens en andere
zoogdieren geidentificeerd zijn gedurende de laatste decennia
- Welke methidologien stonden ter beschikking?
- We vertrekken vanuit fenotype (klinische kenmerken van patient) -->
voorspellen functie ---> proteine ----> gen ---> positie ---> fenotype
- We hebben functionele clonering en positionele clonering.
- Functionele clonering begint bij fenotype, dan functie, dan proteine, dan gen.
- Positionele clonering begint bij fenotype, dan positie, dan gen.
- Bij functionele clonering is hypothese nodig, bij positie niet. Enige wat je doet is
achterhalen waar het gelokaliseerd is, je weet niet wat het gen is. Bij functionele
clonering heb je wel kennis van het gen.
- Voor 1980 was slechts voor een zeer beperkt aantal ziektebeelden het
veroorzakende gen geidentificeerd en gekarakteriseerd.
- Nadien is men dankzij de introductie van nieuwe technologieen en strategien
erin geslaagd voor een grote aantal ziektebeelden bij de mens en andere
zoogdieren de causale genen te identificeren
- Een belangrijk hulpmiddel is hierbij zonder twijfel de beschikbaarheid van de
DNA-sequentie dankzij het “Human Genome Project”.
- De meeste genen die geidentificeerd zijn, liggen aan de basis van monogene
ziektebeelden (veroorzaakt door mutaties in 1 gen) maar er is ook reeds een
sterk toenemende kennis betreffende genetische factoren voor multifactoriele of
complexe aandoeningen
- 2 belangrijke strategien zijn gebruikt voor identificatie van ziektegenen
- Enerzijds functionele clonering waarbij op basis van klinische symptomen
vooropgesteld wordt welke eiwitten mogelijk deficient zouden kunnen zijn om zo
het gen coderend voor dit eiwit te identificeren
- Deze strategie bleek uiteindelijk slechts voor een minimaal aantal ziektebeelden
succesvol te zijn
- Als alternatief werd rond 1980 de strategie van positionele clonering
gesuggereerd. Hierbij wordt getracht een ziektegen te identificeren in 2 stappen:
1. Localisatie ziektegen op het genoom
2. Identificatie van ziektegen uit kandidaatregio
- Deze strategie is uiteindelijk succesvol gehanteerd voor een groot aantal
ziektebeelden.
11.2 Positionele clonering van monogene ziektegenen
- Wetten van Mendel: allelen splitsen en segreggeren willekeurig. Als we kijken
naar gen A heb je A e a. Meiose I: homologen worden gescheiden, Meiose II:
nogmaals scheiding. Er is geen enkele voorkeur om A of a door te geven. Tweede
wet is dat paren van allelen onafhankelijk segreggeren. Alle mogelijke
combinaties van A en B hebben even grote kans om in geslachtscellen terecht te
komen.
- Als we kijken naar structuur van chromosomen bevatten deze heel veel genen
en kan het best zo zijn dat we 2 genen hebben die op zelfde chromosoom
gelegen zijn; A en B. Je kan dan fysische koppeling hebben, ze seggregeren
gekoppeld. Je kan dan cross-over krijgen ter gevolge van chiasmas die gevormd
worden. A en B samen en a en b samen.
,- Genen kunnen dus gekoppeld zijn doordat ze op zelfde chromosoom gelegen
zijn. Hiervan kunnen we gebruik maken bij positionele clonering als we gen willen
positioneren
- Stappen:
1. Localisatie van het gen met koppelingsanalyse
2. Identificatie van het gen
3. Moleculaire en functionele karakterisatie van het gen
Lokalisatie van ziekteveroorzakend gen
- Als we familie bestuderen waarin ziekte overerft, willen we eigenlijk een regio
vinden die samen overerft met de ziekte. Indicatie dat ziekteveroorzakend gen
ligt in deze regio
- Stamboom, we zien met oranje aangetaste individuen. Vader en eerste 3
kinderen hebben aandoening, moeder en 2 volgende kinderen niet. Elk van de
individuen heeft 2 kopien. Moeder heeft 2 gele, vader heeft rood en groen. Alle
kinderen die ziek zijn hebben rode chromsoom van vader gekregen, alle kinderen
die gezond zijn hebben groene chromosoom van vader. Perfecte cosegregatie,
perfecte samen overerving van ziekte met chromosomale regio, in dit geval
hromosoom 5. Geeft indicatie dat ziekteveroorzakend gen wss op 5 ligt. Is niet
realistisch want kan crossover gebeuren
- Volgende stamboom is realistischer. Als je wil kijken of er coseggregatie is moet
je inzoomen op bepaalde regios. Je kijkt per stukje kleur. Dus bovenaan zie je
roze en groen, allebei ziek dus in deze regio ligt het niet. Op volgend stukje wel
perfecte cosegreggatie, dan is er een indicatie dat het daar ligt. We hebben
duidelijk nood aan merkers, merkers voor bepaalde chromosomale regio die
ervoor zorgt dat we overerving in deze regio kunnen volgen
- Als merker kunnen we eiwit gebruiken. We kunnen overerving volgen binnen
familie en kijken of er cosegregatie is tussen bloedgroep en ziekte bijvoorbeeld.
We kunnen hier niet uit afleiden dat de bloedgroep de ziekte veroorzaakt maar
evt wel dat gen verantwoordelijk voor bloedgroep in buurt ligt van
ziekteveroorzakende gen, dus cosegreggatie. Niet makkelijk dus gebruik maken
van varianten polymorfisme op DNA niveau. Veel varianten van individu tot
individu. Kan zijn dat op bepaalde plek van chromosoom T staat en op andere A.
Dit kan je gebruiken om te volgen
- Bijv een kind heeft 2x T in die regio, vader heeft AT dus we kunnen afleiden dat
ene is van vader en andere van moeder
- RFLP: restrictie fragment lengte polymorfisme
- Knippen als er een bepaalde sequentie aanwezig is, allemaal knipplaatsen
- Sequentieverandering, in ene geval knippen en in andere geval niet
- Als we ze scheiden op lengte hebben we verschillende soorten; fragmentlengte
polymorfisme/fragmentlengte variatie. Oftewel 2 korte fragmenten oftewel 1
lange.
- We kunnen ook naar volgende generatie fragment vormen.
- Beperking; je kan niet altijd concluderen of het afkomstigf is van vader of
moeder. Vader is AT, moeder ook, kind ook. Je weet niet welke van welke ouder
komt.
- RLFP is merker
- Alle kinderen erven over van moeder maar we weten niet welke soort
- DNA merker met veel mogelijkheden is nodig. 1-5 ipv 1-2. Je kan dan zien of ze
1,5 zijn ipv 1,2 ofzo.
- RFLP: 2 mogelijkheden, de knipplaats is er wel of niet
- VNTR: variable number of tandem repeats
, Tandem repeats is dat ze na elkaar worden herhaald. Aantal malen dat ze
herhaald worden kan variabel zijn.
- Microsatteliet merker: dinucleotiden (CA), Tri-of tetranucleotiden
Zijn eigenlijk ook tandem repeats maar hebben een hele korte
herhalingssequentie
Heel variabel in aantal van dergelijke repeats
PCR
Veel meer informatie genereren
- PCR: polymerase chain reaction, gebruik maken van 2 polynucleotiden, er wordt
een DNA fragment aangemaakt waarin DNA sequentie vervat ligt. Snel zien
hoeveel CA’s er aanwezig zijn, bijvoorbeeld. Je ziet op ene chromosoom 6 CA’s,
op andere chromosoom 8 CA’s. Als kind ook 6 heeft weet je dat het die van vader
is
- Gekoppelde overerving.
- Overervingspatroon vergelijken met overerving van DNA merkers
- Waarschijnlijkheid dat overheid die we zien te wijten is aan ware koppeling, en
waarschijnlijkheid dat het toeval is (by chance). Als waarde meer dan 3 wordt,
aanvaarden we dit als bewijs dat er effectief fysisiche koppeling is
- LOD score = log P (true linkage)/P (by chance)
- Microsatellietmerkers zijn extreem handig om te zoeken naar
ziekteveroorzakend gen
- Je kan als je grote familie hebt met veel aangetaste individuen kan je alle
chromosomen een voor een afscannen, kijken wat overeenkomt met ziekte. Je
hebt geen idee wat het ziekteveroorzakende gen is, maar positioneren is de
eerste stap
- Recombinatie; meiose cross-over. Ziekteveroorzakende gen kan wel op gen
gelegen zijn, maar regio rond merker kan worden uitgesloten. Alles rond merker
kan worden geexcludeerd. Sleutelrecombinanten dankzij paar individuen
- Hoe groter stamboom is, hoe meer patienten, hoe groter kans dat je
sleutelrecombinanten hebt en je regios kan excluderen. Je weet dan waar je moet
zoeken naar positie, in kleinere regio zoeken.
Genomische localisatie van een ziektegen
- Principe: overerving van ziekte in stambomen vergelijken met overerving van
andere kenmerken.
- Cosegratie (het samen overerven) suggereert dat het ziektegn in de buurt van
het andere kenmerk gelocaliseerd is op het genoom
- Om een grote kans op slagen te hebben dient men te beschikken over bij
voorkeur grote families waarin de ziekte op een duidelijke mendeliaanse wijze
overerft
- Daarnaast heeft men nood aan merkers die toelarten om de overerving van
chromosomale regio’s binnen de familie te volgen
- Hiervoor gebruikt men polymofrismen of varianten waarin 2 of meer vormen
(allelen) binnen een populatie voorkomen
- Initieel kon er slechts gebruik gemaakt worden van eiwitpolymorfismen maar na
introductie van de recombinant-DNA technologie konden ook DNA-polymorfismen
gehanteerd worden.
- Er zijn verschillende vormen van DNA-polymorfismen gebruikt:
Restrictie fragment lengte polymorfismen (RFLP’s)
- Sequentievariatie die knipplaats voor restrictie enzym toevoegt of wegneemt.
