Biochemie: WPO
Scheidingstechnieken
Electroforese
A. Vaste drager bijvoorbeeld cellulosepapier + te scheiden stof aanbrengen
B. In een bak plaatsen met elektrodes en buffer met vaste PH (kathode (-) en annode (+))
C. Vermits moleculen die een lading dragen kunnen we ze op deze manier scheiden (+
moleculen naar –pool en negtaieve moleculen naar +pool)
D. Hoe ver de moleculen gaan is afhankelijk van het isoëlektrisch punt (ip) = de PH
waarbij de nettolading van de moleculen 0 is.
PH > Ip => negatieve lading mol. (PH van de buffer)
PH > Ip => positeve lading mol.
= > we moeten wel altijd de eiwtten zichtbaar maken na reactie => kleureactie
Chromatografie
Dunne laag chromatografie
Bij dunnelaagchromatografie wordt een druppel van een te scheiden mengsel op een plaatje
gebracht. Op dit plaatje zit een dunne laag absorberende stof.
Het plaatje leggen we in een tank van elusiesolvent (butanol/azijn/water). De vaste stof op het
plaatje zuigt de vloeistof vervolgens omhoog. Met de vloeistof worden ook de opgebrachte
vlekken van aminozuren meegenomen. Omdat niet alle aminozuren van het mengsel even snel
met de vloeistof meelopen, vindt er een scheiding plaats. Gaan we het verloop van de vlek
van het mengsel vergelijken met onze gekende aminozuren dan kunnen we dus zien welke
aminozuren er allemaal in ons mengsel zaten. De scheiding bij dunnelaagchromatografie
berust dus op een verschil in adsorptie.
, Kolomchromatografie of gelfiltratie
Het doel van de proef is het scheiden van een mengsel op basis van de grootte van de
verschillende moleculen. Een kolom gevuld met een gel (Sephadex) bestaande uit poreuze
korreltjes is het hoofdbestanddeel van deze proef. Het te scheiden mengsel wordt bovenaan de
kolom op de gel aangebracht. Vervolgens laten we het mengsel door de kolom vorderen.
Tussen de korrels van de gel is redelijk wat plaats maar in de korrels zelf zijn er ook poriën
waarin de kleinste moleculen van het mengsel kunnen binnendringen. De grote moleculen
migreren direct door de tussenruimtes van de gel terwijl de kleine moleculen dus een enorme
lange weg afleggen. Het logische gevolg van dit alles is dus dat de grote moleculen als eerste
beneden aan de kolom in de erlemeyer terecht komen en dus van de kleinere moleculen
gescheiden worden. We maken ook gebruik van een elutiebuffer (Kaliumfosfaat) om de
filtratie vlot te doen verlopen. En om duidelijk te maken welke moleculen het grootst zijn.
Want de regel geldt namelijk dat hoe hoger het elutievolume, hoe meer tijd ze dus nodig
hebben om door de gel te dringen en hoe kleiner de molecules dus zijn
Scheidingstechnieken
Electroforese
A. Vaste drager bijvoorbeeld cellulosepapier + te scheiden stof aanbrengen
B. In een bak plaatsen met elektrodes en buffer met vaste PH (kathode (-) en annode (+))
C. Vermits moleculen die een lading dragen kunnen we ze op deze manier scheiden (+
moleculen naar –pool en negtaieve moleculen naar +pool)
D. Hoe ver de moleculen gaan is afhankelijk van het isoëlektrisch punt (ip) = de PH
waarbij de nettolading van de moleculen 0 is.
PH > Ip => negatieve lading mol. (PH van de buffer)
PH > Ip => positeve lading mol.
= > we moeten wel altijd de eiwtten zichtbaar maken na reactie => kleureactie
Chromatografie
Dunne laag chromatografie
Bij dunnelaagchromatografie wordt een druppel van een te scheiden mengsel op een plaatje
gebracht. Op dit plaatje zit een dunne laag absorberende stof.
Het plaatje leggen we in een tank van elusiesolvent (butanol/azijn/water). De vaste stof op het
plaatje zuigt de vloeistof vervolgens omhoog. Met de vloeistof worden ook de opgebrachte
vlekken van aminozuren meegenomen. Omdat niet alle aminozuren van het mengsel even snel
met de vloeistof meelopen, vindt er een scheiding plaats. Gaan we het verloop van de vlek
van het mengsel vergelijken met onze gekende aminozuren dan kunnen we dus zien welke
aminozuren er allemaal in ons mengsel zaten. De scheiding bij dunnelaagchromatografie
berust dus op een verschil in adsorptie.
, Kolomchromatografie of gelfiltratie
Het doel van de proef is het scheiden van een mengsel op basis van de grootte van de
verschillende moleculen. Een kolom gevuld met een gel (Sephadex) bestaande uit poreuze
korreltjes is het hoofdbestanddeel van deze proef. Het te scheiden mengsel wordt bovenaan de
kolom op de gel aangebracht. Vervolgens laten we het mengsel door de kolom vorderen.
Tussen de korrels van de gel is redelijk wat plaats maar in de korrels zelf zijn er ook poriën
waarin de kleinste moleculen van het mengsel kunnen binnendringen. De grote moleculen
migreren direct door de tussenruimtes van de gel terwijl de kleine moleculen dus een enorme
lange weg afleggen. Het logische gevolg van dit alles is dus dat de grote moleculen als eerste
beneden aan de kolom in de erlemeyer terecht komen en dus van de kleinere moleculen
gescheiden worden. We maken ook gebruik van een elutiebuffer (Kaliumfosfaat) om de
filtratie vlot te doen verlopen. En om duidelijk te maken welke moleculen het grootst zijn.
Want de regel geldt namelijk dat hoe hoger het elutievolume, hoe meer tijd ze dus nodig
hebben om door de gel te dringen en hoe kleiner de molecules dus zijn
