H21: Moleculair biologische technieken in
de celbiologie
1. Analyseren en manipuleren van DNA
Gel elektroforese
= een techniek om DNA van elkaar te onderscheiden op basis van grootte
Nodig:
restrictie-enzymen om DNA te knippen in verschillende grootten
gel
o polyacrylamide voor kleine fragmenten
o agarose voor grote DNA fragmenten
elektrisch veld
buffer oplossing
ethidium bromide om DNA te labelen (zichtbaar door bestraling via UV licht)
DNA ladder: mengsel van DNA fragmenten van gekende lengte
Werking: DNA fragmenten migreren van de negatieve naar de positieve pool obv grootte:
hoe kleiner de fragmenten, hoe sneller de migratie
Pulsed-field elektroforese
= DNA fragmenten groter dan 30 kb die niet door poriën van agarose gel kunnen migreren
scheiden obv grootte
Nodig:
één elektrisch veld langs de as vd gel
twee bijhorende velden die op 60° van de as liggen
Werking: Richting van stroomveld verandert afwisselend. Hoe groter DNA, hoe trager het
duurt eerdat het DNA fragment juist is georiënteerd.
Restrictie endonucleasen
= Restrictie enzymen knippen beide strengen van dsDNA in restrictie fragmenten op
specifieke restrictie sequenties
Restrictie sites: vaak palindromisch, RS van 4 nt: kans op voorkomen 4 4en RS van 6 nt: kans
op voorkomen 46
Oorsprong RE:
geisoleerd uit bacterien (naamgeving obv bacterie + romeins cijfer)
verdediginsmechanisme van bacterie tegen bacteriofagen
knippen viraal DNA uit hun eigen bacterieel DNA (knippen bacterieel DNA niet omdat
herkenningssite van bact DNA gemethyleerd is via methylasen)
, Werking : RE herkennen specifieke sequentie en knippen obv blunt ends (beide strengen op
zelfde plaats geknipt, geen overhang vb HaeIII) of sticky ends (strengen op andere plek
knippen, 5’ of 3’ overhang => kan baseparen vb EcoRI )
Nut:
DNA knippen : normaal DNA te groot en complex om te bestuderen
RE die sticky ends creëren: nut in recombinante DNA technologie
nagaan of DNA gemethyleerd is en dus ook of gen (in)actief is (2 RE die zelfde
sequentie knippen ifv geen of wel methylering: vergelijken)
Restrictie mapping
= DNA behandelen met twee of meerdere restrictie enzymen en ze vervolgens rangschikken
op grootte door elektroforese (belangrijk: rekening houden of DNA circulair of lineair is)
Nut: beschrijft de locatie van alle restrictie sites in oorspronkelijk DNA + DNA identificeren
Southern blot analyse
= DNA fragmenten scheiden obv gel elektroforese, overbrengen naar membraan (blotten),
identificatie via probe hybridisatie en visualisatie
Nodig:
radioactief gemerkte ‘probe’ (stuk enkelstrengig DNA of RNA dat radioactief of
fluorescent gemerkt wordt)
RE
Agarose
Nylon of nitrosecellulair papier (membraan)
Werking:
1. Knippen van genomisch DNA met RE
2. Agarose gelelektroforese
3. Denaturatie van DNA (enkelstrengig maken: noodz voor hybridisatie)
4. Blotten: DNA wordt overgebracht op membraan
5. Hybridisatie: toevoegen van probe
6. Visualisatie van banden waar de probe gebonden is via Xray of UVlicht
Nut: specifieke DNA sequentie identificeren van een mengsel
Beperking: probe op voorhand kiezen
DNA klonen (recombinante DNA technologie)
= van 1 DNA molecule vele DNA moleculen maken
DNA klonen met RE en DNA ligase
= 1 DNA fragment maken van twee verschillende DNA fragmenten (verschillende
oorsprong), recombinaties die niet vrij in de natuur zouden voorkomen (ggo’s)
Nodig:
eenzelfde RE
twee DNA bronnen
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur avdkk. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €4,89. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
