Methoden in biofarmaceutisch onderzoek
Algemene analyse (75%)
H0: HET ANALYTISCH PROCES (p. 4 – 8)
1. VRAAGSTELLING
- algemene vragen omzetten in specifieke vragen (bv. Hoeveel procent van alle Vlamingen gebruikt cocaïne?)
- antwoord vinden --> (anonieme) populatie-enquêtes (betrouwbaarheid??)
--> afvalwater analyseren (metabolieten/componenten drugs komen in ons afvalwater terecht)
2. GEPASTE ANALYTISCHE PROCEDURES SELECTEREN
- zoeken in chemische literatuur
- nieuwe procedures bedenken
3. STAALNAME
homogeen --> willekeurige monsters
heterogeen: - willekeurig --> willekeurige monsters
- gesegregeerd/ontmengd --> gewogen combinatie monsters op willekeurige plaatsen
BEGRIPPEN
- lot = het geheel waaruit het monster (waarop de analyse moet gebeuren) wordt genomen
- bulkmonster = representatief deel van het lot voor analyse --> nog niet bruikbaar voor analyse (o.w.v. contaminatie)
- laboratoriummonster = homogeen, bulkmonster na voorbehandeling (bv. na mixen van een heterogeen bulkmonster)
- aliquot = kleine testhoeveelheid van het monster waarop de individuele analyses worden uitgevoerd
BEWARING
- stabiliteitsstudies --> houdbaarheid, temperatuur en pH (bv. cocaïne pH = 2)
- stabiliteit in functie van de tijd
- vermijd opname van vocht (blootstelling aan lucht)
- vermijd degradatie en contaminatie
- vermijd interactie met recipiënt (bv. bij iononderzoek)
4. STAALVOORBEREIDING
het staal in een vorm brengen die geschikt is voor analyse
- oplossen
- filteren: verwijderen van vaste deeltjes
- solid-phase extraction: opzuiveren en pre-concentreren
-> vaste fase: polymeer/silicagel
-> 1. conditioneren --> voorspoelen/activeren
2. volledige staal door catridge --> analieten kleven aan vaste fase
3. was-stap --> enkel gewenst analiet blijft over
4. elueren/afspoelen --> analiet losmaken van vaste fase
-> belang: bv. hormonen (pil) in kleine concentraties in afvalwater --> negatief voor micro-organismen en vispopulaties
- interferentie: andere verbinding dan de te bepalen beïnvloedt meetsignaal bij analyse --> moet verwijderd worden
- maskeren: transformatie van een interfererende verbinding naar een vorm die niet meer stoort
bv. bepaling van Ca2+ in H2O met EDTA:
Ca2+ + EDTA4- → Ca(EDTA)2
Al3+ + EDTA4- → Al(EDTA)-
Al3+ +6 F- → AlF3- → geen reactie met EDTA
5. ANALYSE
fysico-chemische analyse: instrumentele analyse:
- kleur en neerslag - spectrofotometrie (UV-vis, IR)
- titraties - massaspectrometrie
- pH-meting, smelt- en kookpunt - scheidingstechnieken: chromatografie (dunnelaag/vloeistof/gas), capillaire elektroforese
werking vloeistofchromatografie:
- kolom met vaste fase (poeder) -> vloeistof door kolom gepompt (onder hoge druk om tegendruk poeder te compenseren)
- staal injecteren -> door kolom getrokken -> interacties met poeder -> minder interacties = lagere affiniteit = trager
--> chromatogram: positie piek --> welke component? (bepalen m.b.v. ijk-/calibratie-/standaardcurve)
grootte/oppervlakte piek --> hoeveel?
6. RESULTATEN INTERPRETEREN EN ANALYSEREN
- metingen herhalen --> standaardafwijking bepalen
- betrouwbaarheid nagaan
7. CONCLUSIES TREKKEN
1
,H1: METINGEN (p. 9 – 23)
INLEIDING
- vroeger geen standaardisatie van meeteenheden (bv. voet, el, duim, zaden en steen)
- Franse revolutie: eerste hervorming (metrieke stelsel -> o.b.v. wetenschappelijke waarnemingen)
- 1875: Meter Convention (Parijs): 17 naties
- 1948: Système International (d’unités) --> SI-eenheden
Nationaal Metrologisch Instituut
- VS: National Institute of Standardization and Technology (NIST)
- BE: Metrologische Dienst, Ministerie van Economische Zaken
1.1 SI-EENHEDEN
SI-EENHEDEN AFGELEIDE SI-EENHEDEN PREFIXEN
lengte (m) frequentie (Hz = 1/s) yotta (Y) 1024 deci (d) 10-1
massa (kg) = prototype kracht (N = m.kg/s²) zetta (Z) 1021 centi (c) 10-2
tijd (s) druk (Pa = kg/m.s²) exa (E) 1018 milli (m) 10-3
stroom (A) energie, arbeid en warmte (J = m².kg/s²) peta (P) 1015 micro (μ) 10-6
temperatuur (K) vermogen (W = m².kg/s³) tera (T) 1012 nano (n) 10-9
lichtintensiteit (candela, cd) elektrische lading (C = s.A) giga (G) 109 pico (p) 10-12
hoeveelheid stof (mol) elektrische potentiaal (V = m².kg/s³.A) mega (M) 106 femto (f) 10-15
vlakke hoek (rad) elektrische weerstand ( = m².kg/s³.A²) kilo (k) 103 atto (a) 10-18
sferische hoek (steradian, sr) elektrische capaciteit (Farad, F = s4.A²/m².kg) hecto (h) 102 zepto (z) 10-21
deca (da) 101 yocto (y) 10-24
CONVERSIE VAN EENHEDEN
1.2 CHEMISCHE CONCENTRATIES
1.2.1 BEGRIPPEN
- concentratie: geeft aan hoeveel opgeloste stof aanwezig is in een gegeven volume/massa oplossing
- molariteit (cM of M): aantal mol opgeloste stof per liter oplossing (1 mol = 6,0223.1023 deeltjes en 1L = 10-3 m³)
- elektrolyt: substantie die in oplossing dissocieert in ionen
zwak elektrolyt: grootste deel niet gedissocieerd, bv. CH3COOH
sterk elektrolyt: grootste deel gedissocieerd, bv. 0,44 M MgCl2 --> 70 % Mg2+ en 30 % MgCl+, nagenoeg geen MgCl2
= formele concentratie (cF of F)
- molaliteit (m): aantal mol stof per kg solvent (onafhankelijk van temperatuur)
mA
- massaprocent (of gewichtsprocent): % m/m . 100 (aantal g stof per 100g mengsel)
mtot
VA
- volumeprocent: % V/V . 100 (aantal ml stof per 100ml mengsel)
Vtot
mA
- gewicht/volumeprocent: %m/V . 100 (aantal g stof per 100ml mengsel)
Vtot
mA
- ppm (parts per million): . 106 (aantal μg stof per g mengsel)
mtot
mA
- ppb (parts per billion): . 109 (aantal ng stof per g mengsel)
mtot
1.2.2 BEREIDING VAN OPLOSSINGEN MET BEPAALDE MOLARITEIT
1. weeg nodige hoeveelheid stof af
2. voeg ong. 75 % van totale hoeveelheid solvent toe
3. sluit maatkolf af en zwenk tot product is opgelost
4. open maatkolf en leng aan tot maatstreep
5. sluit maatkolf opnieuw en keer 20 maal om voor volledige menging
1.2.3 VERDUNNING
M concentratie · V concentratie = M verdunning · V verdunning
1.3 OPLOSSINGEN EN STOECHIOMETRIE
bv. Gravimetrische bepaling van Fe in Fe(II)-fumaraat tabletten --> zie cursus p. 20 – 22
2
, H2: INSTRUMENTARIUM (p. 24 – 49)
2.1 VEILIGHEID
- tot 2010 R(isk) en S(afety) zinnen
- sinds 2011 H(azard) en P(recautionary) zinnen
HXYY
-> H = hazard = gevaar
-> X = gevarenklasse (2 = fysische gevaren, 3 = gezondheidsgevaren en 4 = milieugevaren)
-> Y = nummer van zin binnen een bepaald gevaar: bv. 200-210: explosiviteit
220-230: brandbaarheidsgevaar
300-310: acute giftigheid
PXYY
-> P = precaution = voorzorg
-> X = veiligheidsaanbevelingen (1 = algemeen, 2 = preventie, 3 = reactie, 4 = opslag en 5 = verwijdering)
-> Y = nummer van zin binnen een bepaalde groep
- Pictogrammen en gevaarsymbolen GHS (Globally Harmonised System of Classification and Labelling of Chemicals
Fysische gevaren Gezondheidsgevaren Milieugevaar
2.2 AFVAL EN LABOBOEK --> zie p. 27
2.3 ANALYTISCHE BALANS
weegcapaciteit: 100 – 200 g
gevoeligheid: 0,01 – 0,1 mg
2.3.1 MECHANISCHE ANALYTISCHE BALANS
1. voorwerp op schaal --> schaal naar beneden gedrukt met kracht (F = m · g)
2. operator kan via draaiknoppen hendeltjes in beweging zetten die gewichtjes boven schaal verwijderen
3. verwijderde gewichtjes ong. even groot als te wegen voorwerp --> balans opnieuw zo goed als in evenwicht
4. event. overblijvende afwijking aflezen op optische schaal
2.3.2 ELEKTRONISCHE ANALYTISCHE BALANS
1. nuldetector merkt verplaatsing van schaal --> foutsignaal --> correctiestroom door spoel
--> creëert magnetisch veld, afgestoten door permanente magneet
2. balans terug in oorspronkelijke positie
3. vereiste elektrische stroom is evenredig met massa op de schaal --> weergegeven op display
2.3.3 AFWEGEN PRAKTISCH
verschilweging of differentieelweging:
- indien tarra recipiënt hoger is dan capaciteit balans
- in weegschuitje --> wegen --> “zoveel als mogelijk” over in groter recipiënt --> weeg weegschuitje opnieuw --> bereken verschil
weegfouten vermijden: p. 31
ijking van een balans: d.m.v. ijk- of kalibratiegewichten, g is afhankelijk van locatie op aarde -> regelmatig opnieuw kalibreren
2.3.5 ‘BUOYANCY’
- drijfvermogen, i.v.m. balans best te vertalen als “opwaartse kracht”
- schijnbare massa (die men afleest) is kleiner dan de actuele massa (die men zou meten in het luchtledige)
- indien densiteit te wegen stof verschilt van ijkgewichten moet er dus (in principe) een correctie worden uitgevoerd:
𝐝
𝐦′ (𝟏 − 𝐚 )
𝐝𝐰
𝐦= 𝐝 (indien d = dw --> m = m’)
𝟏− 𝐚
𝐝
m = werkelijke massa da = densiteit van lucht (0,0012 g/mL bij 105 Pa en 25 °C)
m’ = massa afgelezen op balans dw = densiteit van ijkgewichten (typisch 8,0 g/mL)
d = densiteit van te wegen voorwerp
2.4 BURETTEN
= zeer nauwkeurig gefabriceerde glazen buis met verdelingen erop die toelaten om het volume af te lezen.
- toleranties klasse A, bv. bij 50mL buret ±0,05mL
- meniscus altijd aflezen op ooghoogte --> anders parallaxfout
- markeringen hebben niet verwaarloosbare dikte --> voor correct gebruik moet één kant markeringen als nul gekozen worden
Let op voor: (p. 36 – 37)
- vloeistoffen moeten gelijkmatig van de wand van de buret aflopen
- luchtbel direct onder stopkraan
- niet-afgevallen druppel onderaan pipetpunt
3
Algemene analyse (75%)
H0: HET ANALYTISCH PROCES (p. 4 – 8)
1. VRAAGSTELLING
- algemene vragen omzetten in specifieke vragen (bv. Hoeveel procent van alle Vlamingen gebruikt cocaïne?)
- antwoord vinden --> (anonieme) populatie-enquêtes (betrouwbaarheid??)
--> afvalwater analyseren (metabolieten/componenten drugs komen in ons afvalwater terecht)
2. GEPASTE ANALYTISCHE PROCEDURES SELECTEREN
- zoeken in chemische literatuur
- nieuwe procedures bedenken
3. STAALNAME
homogeen --> willekeurige monsters
heterogeen: - willekeurig --> willekeurige monsters
- gesegregeerd/ontmengd --> gewogen combinatie monsters op willekeurige plaatsen
BEGRIPPEN
- lot = het geheel waaruit het monster (waarop de analyse moet gebeuren) wordt genomen
- bulkmonster = representatief deel van het lot voor analyse --> nog niet bruikbaar voor analyse (o.w.v. contaminatie)
- laboratoriummonster = homogeen, bulkmonster na voorbehandeling (bv. na mixen van een heterogeen bulkmonster)
- aliquot = kleine testhoeveelheid van het monster waarop de individuele analyses worden uitgevoerd
BEWARING
- stabiliteitsstudies --> houdbaarheid, temperatuur en pH (bv. cocaïne pH = 2)
- stabiliteit in functie van de tijd
- vermijd opname van vocht (blootstelling aan lucht)
- vermijd degradatie en contaminatie
- vermijd interactie met recipiënt (bv. bij iononderzoek)
4. STAALVOORBEREIDING
het staal in een vorm brengen die geschikt is voor analyse
- oplossen
- filteren: verwijderen van vaste deeltjes
- solid-phase extraction: opzuiveren en pre-concentreren
-> vaste fase: polymeer/silicagel
-> 1. conditioneren --> voorspoelen/activeren
2. volledige staal door catridge --> analieten kleven aan vaste fase
3. was-stap --> enkel gewenst analiet blijft over
4. elueren/afspoelen --> analiet losmaken van vaste fase
-> belang: bv. hormonen (pil) in kleine concentraties in afvalwater --> negatief voor micro-organismen en vispopulaties
- interferentie: andere verbinding dan de te bepalen beïnvloedt meetsignaal bij analyse --> moet verwijderd worden
- maskeren: transformatie van een interfererende verbinding naar een vorm die niet meer stoort
bv. bepaling van Ca2+ in H2O met EDTA:
Ca2+ + EDTA4- → Ca(EDTA)2
Al3+ + EDTA4- → Al(EDTA)-
Al3+ +6 F- → AlF3- → geen reactie met EDTA
5. ANALYSE
fysico-chemische analyse: instrumentele analyse:
- kleur en neerslag - spectrofotometrie (UV-vis, IR)
- titraties - massaspectrometrie
- pH-meting, smelt- en kookpunt - scheidingstechnieken: chromatografie (dunnelaag/vloeistof/gas), capillaire elektroforese
werking vloeistofchromatografie:
- kolom met vaste fase (poeder) -> vloeistof door kolom gepompt (onder hoge druk om tegendruk poeder te compenseren)
- staal injecteren -> door kolom getrokken -> interacties met poeder -> minder interacties = lagere affiniteit = trager
--> chromatogram: positie piek --> welke component? (bepalen m.b.v. ijk-/calibratie-/standaardcurve)
grootte/oppervlakte piek --> hoeveel?
6. RESULTATEN INTERPRETEREN EN ANALYSEREN
- metingen herhalen --> standaardafwijking bepalen
- betrouwbaarheid nagaan
7. CONCLUSIES TREKKEN
1
,H1: METINGEN (p. 9 – 23)
INLEIDING
- vroeger geen standaardisatie van meeteenheden (bv. voet, el, duim, zaden en steen)
- Franse revolutie: eerste hervorming (metrieke stelsel -> o.b.v. wetenschappelijke waarnemingen)
- 1875: Meter Convention (Parijs): 17 naties
- 1948: Système International (d’unités) --> SI-eenheden
Nationaal Metrologisch Instituut
- VS: National Institute of Standardization and Technology (NIST)
- BE: Metrologische Dienst, Ministerie van Economische Zaken
1.1 SI-EENHEDEN
SI-EENHEDEN AFGELEIDE SI-EENHEDEN PREFIXEN
lengte (m) frequentie (Hz = 1/s) yotta (Y) 1024 deci (d) 10-1
massa (kg) = prototype kracht (N = m.kg/s²) zetta (Z) 1021 centi (c) 10-2
tijd (s) druk (Pa = kg/m.s²) exa (E) 1018 milli (m) 10-3
stroom (A) energie, arbeid en warmte (J = m².kg/s²) peta (P) 1015 micro (μ) 10-6
temperatuur (K) vermogen (W = m².kg/s³) tera (T) 1012 nano (n) 10-9
lichtintensiteit (candela, cd) elektrische lading (C = s.A) giga (G) 109 pico (p) 10-12
hoeveelheid stof (mol) elektrische potentiaal (V = m².kg/s³.A) mega (M) 106 femto (f) 10-15
vlakke hoek (rad) elektrische weerstand ( = m².kg/s³.A²) kilo (k) 103 atto (a) 10-18
sferische hoek (steradian, sr) elektrische capaciteit (Farad, F = s4.A²/m².kg) hecto (h) 102 zepto (z) 10-21
deca (da) 101 yocto (y) 10-24
CONVERSIE VAN EENHEDEN
1.2 CHEMISCHE CONCENTRATIES
1.2.1 BEGRIPPEN
- concentratie: geeft aan hoeveel opgeloste stof aanwezig is in een gegeven volume/massa oplossing
- molariteit (cM of M): aantal mol opgeloste stof per liter oplossing (1 mol = 6,0223.1023 deeltjes en 1L = 10-3 m³)
- elektrolyt: substantie die in oplossing dissocieert in ionen
zwak elektrolyt: grootste deel niet gedissocieerd, bv. CH3COOH
sterk elektrolyt: grootste deel gedissocieerd, bv. 0,44 M MgCl2 --> 70 % Mg2+ en 30 % MgCl+, nagenoeg geen MgCl2
= formele concentratie (cF of F)
- molaliteit (m): aantal mol stof per kg solvent (onafhankelijk van temperatuur)
mA
- massaprocent (of gewichtsprocent): % m/m . 100 (aantal g stof per 100g mengsel)
mtot
VA
- volumeprocent: % V/V . 100 (aantal ml stof per 100ml mengsel)
Vtot
mA
- gewicht/volumeprocent: %m/V . 100 (aantal g stof per 100ml mengsel)
Vtot
mA
- ppm (parts per million): . 106 (aantal μg stof per g mengsel)
mtot
mA
- ppb (parts per billion): . 109 (aantal ng stof per g mengsel)
mtot
1.2.2 BEREIDING VAN OPLOSSINGEN MET BEPAALDE MOLARITEIT
1. weeg nodige hoeveelheid stof af
2. voeg ong. 75 % van totale hoeveelheid solvent toe
3. sluit maatkolf af en zwenk tot product is opgelost
4. open maatkolf en leng aan tot maatstreep
5. sluit maatkolf opnieuw en keer 20 maal om voor volledige menging
1.2.3 VERDUNNING
M concentratie · V concentratie = M verdunning · V verdunning
1.3 OPLOSSINGEN EN STOECHIOMETRIE
bv. Gravimetrische bepaling van Fe in Fe(II)-fumaraat tabletten --> zie cursus p. 20 – 22
2
, H2: INSTRUMENTARIUM (p. 24 – 49)
2.1 VEILIGHEID
- tot 2010 R(isk) en S(afety) zinnen
- sinds 2011 H(azard) en P(recautionary) zinnen
HXYY
-> H = hazard = gevaar
-> X = gevarenklasse (2 = fysische gevaren, 3 = gezondheidsgevaren en 4 = milieugevaren)
-> Y = nummer van zin binnen een bepaald gevaar: bv. 200-210: explosiviteit
220-230: brandbaarheidsgevaar
300-310: acute giftigheid
PXYY
-> P = precaution = voorzorg
-> X = veiligheidsaanbevelingen (1 = algemeen, 2 = preventie, 3 = reactie, 4 = opslag en 5 = verwijdering)
-> Y = nummer van zin binnen een bepaalde groep
- Pictogrammen en gevaarsymbolen GHS (Globally Harmonised System of Classification and Labelling of Chemicals
Fysische gevaren Gezondheidsgevaren Milieugevaar
2.2 AFVAL EN LABOBOEK --> zie p. 27
2.3 ANALYTISCHE BALANS
weegcapaciteit: 100 – 200 g
gevoeligheid: 0,01 – 0,1 mg
2.3.1 MECHANISCHE ANALYTISCHE BALANS
1. voorwerp op schaal --> schaal naar beneden gedrukt met kracht (F = m · g)
2. operator kan via draaiknoppen hendeltjes in beweging zetten die gewichtjes boven schaal verwijderen
3. verwijderde gewichtjes ong. even groot als te wegen voorwerp --> balans opnieuw zo goed als in evenwicht
4. event. overblijvende afwijking aflezen op optische schaal
2.3.2 ELEKTRONISCHE ANALYTISCHE BALANS
1. nuldetector merkt verplaatsing van schaal --> foutsignaal --> correctiestroom door spoel
--> creëert magnetisch veld, afgestoten door permanente magneet
2. balans terug in oorspronkelijke positie
3. vereiste elektrische stroom is evenredig met massa op de schaal --> weergegeven op display
2.3.3 AFWEGEN PRAKTISCH
verschilweging of differentieelweging:
- indien tarra recipiënt hoger is dan capaciteit balans
- in weegschuitje --> wegen --> “zoveel als mogelijk” over in groter recipiënt --> weeg weegschuitje opnieuw --> bereken verschil
weegfouten vermijden: p. 31
ijking van een balans: d.m.v. ijk- of kalibratiegewichten, g is afhankelijk van locatie op aarde -> regelmatig opnieuw kalibreren
2.3.5 ‘BUOYANCY’
- drijfvermogen, i.v.m. balans best te vertalen als “opwaartse kracht”
- schijnbare massa (die men afleest) is kleiner dan de actuele massa (die men zou meten in het luchtledige)
- indien densiteit te wegen stof verschilt van ijkgewichten moet er dus (in principe) een correctie worden uitgevoerd:
𝐝
𝐦′ (𝟏 − 𝐚 )
𝐝𝐰
𝐦= 𝐝 (indien d = dw --> m = m’)
𝟏− 𝐚
𝐝
m = werkelijke massa da = densiteit van lucht (0,0012 g/mL bij 105 Pa en 25 °C)
m’ = massa afgelezen op balans dw = densiteit van ijkgewichten (typisch 8,0 g/mL)
d = densiteit van te wegen voorwerp
2.4 BURETTEN
= zeer nauwkeurig gefabriceerde glazen buis met verdelingen erop die toelaten om het volume af te lezen.
- toleranties klasse A, bv. bij 50mL buret ±0,05mL
- meniscus altijd aflezen op ooghoogte --> anders parallaxfout
- markeringen hebben niet verwaarloosbare dikte --> voor correct gebruik moet één kant markeringen als nul gekozen worden
Let op voor: (p. 36 – 37)
- vloeistoffen moeten gelijkmatig van de wand van de buret aflopen
- luchtbel direct onder stopkraan
- niet-afgevallen druppel onderaan pipetpunt
3
