Analyse van DNA
Methoden hoofdstuk 13
DNA extraheren
1. Lyseren = cellen afbreken zodat DNA vrijkomt
- Detergenten zoals SDS, Trizol, Guanidium chloride …
- Invriezen en ontdooien
└ Cellen leefbaar houden: invriezen via cryopreservatie
- Mechanische homogenisatie
└ Pletten in vloeibare stikstof tot poeder in mortier met pestel
└ Beads toevoegen en schudden aan hoge snelheid
- Vloeibare homogenisatie
└ Douncer = oplossing tussen glazen pestels
Houdt organellen intact
- Sonicatie (geluidsgolven)
DNA isoleren uit bloedstaal
- Antistollingsmiddel toevoegen = EDTA
- Witte bloedcellen hebben kern en dus DNA
- Rode bloedcellen hebben geen kern eerst deze lyseren via NH4Cl
DNA isoleren uit weefsel
- Pletten in vloeibare stikstof tot poeder in mortier met pestel
DNA isoleren uit cellen
- Detergent SDS toevoegen voor eiwitdenaturatie en afbraak van membranen
- Enzymes die eiwitten & RNA afbreken toevoegen (proteasen & RNase)
- EDTA toevoegen inhiberen van DNasen doordat het Mg2+ complexeert
, 2. DNA isoleren = DNA uit lysaat halen of opzuiveren, eiwitten en RNA afbreken
- Via organische solventen denatureren eiwitten
1) Aan lysaat fenol-chloroform toevoegen
2) DNA nu gescheiden van RNA en eiwitten
3) Waterlaag met DNA overbrengen naar nieuwe tube
4) Alcoholprecipitatie van DNA uit waterlaag
- Via ontzouting eiwitten en celdebris slaan neer door hoge zoutconcentratie
1) Alcoholprecipitatie van DNA uit supernatans (bovenstaande waterlaag)
2) Zout + alcohol toevoegen waardoor DNA zich oprolt
3) DNA vlok met pasteurpipet opvissen en overbrengen in nieuwe tube
- Via kolomchromatografie DNA bindt selectief aan matrix in kolommetjes
Silica kolom
1) Buffer met chaotrope zouten lysis, inhibitie nuclease & binding DNA kolom
2) Spin kolom = vloeistof door kolom sturen door centrifugeren
3) Elutie van DNA = losmaken
Anionenuitwisselingschromatografie
└ Bij lage zoutconcentratie elueren RNA en eiwitten wegwassen
└ Bij hoge zoutconcentratie elueert DNA
- Alkalische lyse extractie van plasmiden uit bacteriën
1) SDS toegepast
2) NaOH zorgt voor denaturatie van DNA
3) Denaturatie bacterieel chromosoom en plasmide DNA
4) Neutraliseren: enkel plasmide DNA renatureert
5) Alcoholprecipitatie of anionenuitwisselingschromatografie zuivert plasmide
Methoden hoofdstuk 13
DNA extraheren
1. Lyseren = cellen afbreken zodat DNA vrijkomt
- Detergenten zoals SDS, Trizol, Guanidium chloride …
- Invriezen en ontdooien
└ Cellen leefbaar houden: invriezen via cryopreservatie
- Mechanische homogenisatie
└ Pletten in vloeibare stikstof tot poeder in mortier met pestel
└ Beads toevoegen en schudden aan hoge snelheid
- Vloeibare homogenisatie
└ Douncer = oplossing tussen glazen pestels
Houdt organellen intact
- Sonicatie (geluidsgolven)
DNA isoleren uit bloedstaal
- Antistollingsmiddel toevoegen = EDTA
- Witte bloedcellen hebben kern en dus DNA
- Rode bloedcellen hebben geen kern eerst deze lyseren via NH4Cl
DNA isoleren uit weefsel
- Pletten in vloeibare stikstof tot poeder in mortier met pestel
DNA isoleren uit cellen
- Detergent SDS toevoegen voor eiwitdenaturatie en afbraak van membranen
- Enzymes die eiwitten & RNA afbreken toevoegen (proteasen & RNase)
- EDTA toevoegen inhiberen van DNasen doordat het Mg2+ complexeert
, 2. DNA isoleren = DNA uit lysaat halen of opzuiveren, eiwitten en RNA afbreken
- Via organische solventen denatureren eiwitten
1) Aan lysaat fenol-chloroform toevoegen
2) DNA nu gescheiden van RNA en eiwitten
3) Waterlaag met DNA overbrengen naar nieuwe tube
4) Alcoholprecipitatie van DNA uit waterlaag
- Via ontzouting eiwitten en celdebris slaan neer door hoge zoutconcentratie
1) Alcoholprecipitatie van DNA uit supernatans (bovenstaande waterlaag)
2) Zout + alcohol toevoegen waardoor DNA zich oprolt
3) DNA vlok met pasteurpipet opvissen en overbrengen in nieuwe tube
- Via kolomchromatografie DNA bindt selectief aan matrix in kolommetjes
Silica kolom
1) Buffer met chaotrope zouten lysis, inhibitie nuclease & binding DNA kolom
2) Spin kolom = vloeistof door kolom sturen door centrifugeren
3) Elutie van DNA = losmaken
Anionenuitwisselingschromatografie
└ Bij lage zoutconcentratie elueren RNA en eiwitten wegwassen
└ Bij hoge zoutconcentratie elueert DNA
- Alkalische lyse extractie van plasmiden uit bacteriën
1) SDS toegepast
2) NaOH zorgt voor denaturatie van DNA
3) Denaturatie bacterieel chromosoom en plasmide DNA
4) Neutraliseren: enkel plasmide DNA renatureert
5) Alcoholprecipitatie of anionenuitwisselingschromatografie zuivert plasmide
