Celbiologie
1.Techniek
inleiding
Stabiele cellijnen: afkomstig van tumoren -> immortalisatie
Contactinhibitie van celproliferatie van mitogenen
Adherente cellen splitsen:
=> trypsine: oppervlakte eiwitten splitsen
=> EDTA: calcium en magnesium losmaken
Totipotent: eerste uren na bevruchting, kan zich tot foetus ontwikkelen
Pluripotent: 4 dagen na bevruchting, blastocyst -> kan niet meer tot foetus
ontwikkelen zonder placenta
Multipotent: specifieke cellen kunnen nog tot verschillende cellen binnen een
bepaald weefsel evolueren. (bloedplaatsjes, rode bloedcellen,..)
Prepareren
Fixeren: afbraakenzymen tegengaan door denaturatie
Bevriezen: snel en behoud epitopen voor kleuring, in LM
Chemische fixatie: door formol of glutaraldehyde, betere morfologie
Veranderingen die gebeuren tijdens fixatie = artefacten
Inbedden: hard maken om te kunnen snijden
Niet bij koudefixatie
Meestal hydrofoob -> eerst water verwijderen uit cel door alcohol
Harsen zijn hydrofoob met hydrofiele groepen op -> minder stabiel
Paraffine, harsen en plastics
Snijden:
Met paraffine: voor LM, zacht coupes (5-10 micrometer)
Microtoom mes uit staal
Harsen, plastics: voor EM, hardere coupes (60-70nm), minder immuun kleuring
Microtoom mes uit glas of diamant
, Microscopen
microscoop kleuring werking
Klaarveldmicroscoop PAS = vrij suikers Breken licht
200nm aankleuren Condensor, objectief en oculair
Hematoxyline: base
Eosine: zuur
Fasecontrastmicroscoop Ongekleurde Kleine faseveranderingen door
Voor levende cellen preparaten kleine brekingsverschillen in
preparaat
Fluorescentiemicroscoop Fluorescerende Epifluorescentie: excitatielicht
kleurstoffen = korte golflengte
fluorochromen Emissie lange golflengte
Ion-gevoelige Door kwiklamp
kleurstoffen: conc Confocale laser scanning
ionen microscopie (CLSM)
Immunofluorescentie:
specifieke eiw, mbv
antilichamen
Tagging: specifieke eiw in
levende cellen
4D door time lapse
Flowcytometrie: techniek voor
tellen cellen
Transmissie Elektronen Negatieve kleuring Elektronenverstrooiing
microscoop (TEM) Zware metalen bv Zware atomen
1nm osmium: Ultradun preparaat
donker/licht Hoog vacuüm
contrast Vooral om binnenkant
Shadowing en rotary objecten te zien
shadowing: platina en
1.Techniek
inleiding
Stabiele cellijnen: afkomstig van tumoren -> immortalisatie
Contactinhibitie van celproliferatie van mitogenen
Adherente cellen splitsen:
=> trypsine: oppervlakte eiwitten splitsen
=> EDTA: calcium en magnesium losmaken
Totipotent: eerste uren na bevruchting, kan zich tot foetus ontwikkelen
Pluripotent: 4 dagen na bevruchting, blastocyst -> kan niet meer tot foetus
ontwikkelen zonder placenta
Multipotent: specifieke cellen kunnen nog tot verschillende cellen binnen een
bepaald weefsel evolueren. (bloedplaatsjes, rode bloedcellen,..)
Prepareren
Fixeren: afbraakenzymen tegengaan door denaturatie
Bevriezen: snel en behoud epitopen voor kleuring, in LM
Chemische fixatie: door formol of glutaraldehyde, betere morfologie
Veranderingen die gebeuren tijdens fixatie = artefacten
Inbedden: hard maken om te kunnen snijden
Niet bij koudefixatie
Meestal hydrofoob -> eerst water verwijderen uit cel door alcohol
Harsen zijn hydrofoob met hydrofiele groepen op -> minder stabiel
Paraffine, harsen en plastics
Snijden:
Met paraffine: voor LM, zacht coupes (5-10 micrometer)
Microtoom mes uit staal
Harsen, plastics: voor EM, hardere coupes (60-70nm), minder immuun kleuring
Microtoom mes uit glas of diamant
, Microscopen
microscoop kleuring werking
Klaarveldmicroscoop PAS = vrij suikers Breken licht
200nm aankleuren Condensor, objectief en oculair
Hematoxyline: base
Eosine: zuur
Fasecontrastmicroscoop Ongekleurde Kleine faseveranderingen door
Voor levende cellen preparaten kleine brekingsverschillen in
preparaat
Fluorescentiemicroscoop Fluorescerende Epifluorescentie: excitatielicht
kleurstoffen = korte golflengte
fluorochromen Emissie lange golflengte
Ion-gevoelige Door kwiklamp
kleurstoffen: conc Confocale laser scanning
ionen microscopie (CLSM)
Immunofluorescentie:
specifieke eiw, mbv
antilichamen
Tagging: specifieke eiw in
levende cellen
4D door time lapse
Flowcytometrie: techniek voor
tellen cellen
Transmissie Elektronen Negatieve kleuring Elektronenverstrooiing
microscoop (TEM) Zware metalen bv Zware atomen
1nm osmium: Ultradun preparaat
donker/licht Hoog vacuüm
contrast Vooral om binnenkant
Shadowing en rotary objecten te zien
shadowing: platina en
