Hoofdstuk 10: Gene isolation and manipulation
PCR: om een bekende mutatie te detecteren
TAQ Polymerase: chemotroof, doet het goed bij 70 °C en kan goed
leven tussen 50°C en 80°C
Als de mutatie groot is (deletie/duplicatie>50bp) PCR product op
agarose gel
Als de mutatie klein is (SNP, insertie, deletie) selectieve primer
- Wildtype: geen PCR product
- Mutant: wel PCR product
Dan de PCR fragmenten op een gel
DNA kleuren: gebeurt met ethydium bromide, dan UV licht
Humaan gen in een ander organisme tot expressie brengen:
Al het mRNA uit het weefsel isoleren
Reverse transcriptie cDNA
Restrictie enzymen ligatie in vector kloneren
Sticky ends maken:
Speciale PCR primers met extra eind (restriction site)
Ligeer adapters die de gewenste restriction sites bevatten aan je
cDNA (linkers)
Genexpressie onderzoeken:
mRNA extractie
cDNA synthese en labelen
Op microarray plaatsen
Hoofdstuk 13: Development and evolution
Housekeeping genen: actief in alle weefsels
Weefselspecifieke genen: bepalen de aard van een weefsel
Toolbox genen:
Actief tijdens embryonale ontwikkeling
Groot effect
Bilateraal effect
Mutant heeft fenotype waarin min of meer normale lichaamsdelen op de verkeerde plek
zitten
Het probleem:
Eicel heeft geen polariteit (anterior, posterior enz.)
Embryo moet worden verdeeld in stukjes die een andere functie krijgen
- Ectoderm (buitenkant en zenuwstelsel)
- Mesoderm (tussenlaag)
- Endoderm (binnenkant)
Functionele segmenten: meeste dieren, bij insecten heeft elk segment een andere functie
,Logica van patroon generatie in het vroege embryo:
Een cascade van inducties kan het gehele embryo van een patroon voorzien
Deze patronen genereren positionele informatie dat bepaalt wat iedere cel wordt
Maternale mRNA’s induceren polariteit in het embryo (bicoid)
Bicoid eiwit diffundeert door embryo, er ontstaat een gradiënt
Zorgt ervoor dat het embryo een voor en achterkant krijgt
Bicoid bepaalt de positie van de kop
In situ-hybridisatie: mRNA kleuren met een gelabelde probe
Immunolokalisatie: eiwit kleuren met een gelabeld antilichaam
Maternale mRNA: reguleren expressie van GAP en pair-rule genen, balen de A-P
en D-V as van het embryo
Bicoid (transcriptie facor)
Nanos (transcriptie repressor)
Reguleren GAP genexpressie: 4 eiwit expressie banden
- Hunchback
- Caudal worden later door de zygote gemaakt
De GAP eiwitten binden aan de enhancers van pair-rule genen
Pair-rule genen: 7 banden, reguleren de transcriptie van segment polarity genen
Mutanten missen delen van de segmenten
Segment-polarity genen: 14 banden, komen tot expressie in een deel van ieder
segment, bepalen het patroon van cel-differentiatie in ieder segment
Reguleren HOX genexpressie
Hox genen: bepalen wat een segment gaat doen, twee clusters op chromosoom 3, volgt A-P as
Vertebraten hebben vier cluster van HOX genen
Distalless: Dll, op verkeerde segmenten pootjes, combinatie van ultrabithorax (Ubx) en abdominal-A
(abd-A) onderdrukt Dll expressie in abdomen
Wordt onderdrukt door HOX genen, daarnaast nog vier:
Sloppy paired (segment-polarity)
Engrailed (segment-polarity)
Extradentical
Homothorax
Verschillen in HOXC-6 expressie zorgen ervoor dat nekwervels op andere plekken beginnen in muis
en kip
Hoofdstuk 14: Genomes and genomes
Genoom projecten: het klonen en sequencen van het hele genoom van een geselecteerd organisme
Human Genome Project: laat zien hoe wetenschap, technologie, het bedrijfsleven, de politiek
en ethiek elkaar beïnvloeden
ddNTP’s: bevatten dideoxyribose i.p.v. deoxyribose, als deze wordt ingebouwd kan de keten niet
verder worden gesynthetiseerd
, Sanger sequencing: stuk DNA, primer, dNTP’s. TAQ polymerase en
ddNTP’s PCR reactie, beperkingen:
Slechtere kwaliteit
Geeft relatief lange ‘reads’ van goede kwaliteit
Genen die in de natuur voorkomen zijn niet langer te patenteren, maar
synthetisch DNA wel, bijvoorbeeld:
Gemodificeerde genen
cDNA
Whole-genome shotgun sequencing: een lang chromosoom wordt in
kleine stukjes verdeeld en van elk stukje wordt de sequentie bepaald, de
overlap tussen de reads wordt gebruikt om alles aan elkaar te puzzelen
Pyrosequencing: (454 sequencing), omste beurt wordt dATP, dGTP,
dCTP en dTTP toegevoegd en als de dNTP bindt dan is er een
lichtflitsje en dit geeft aan welke base op die plek zit
DNA moleculen in miljoenen kleine random stukjes knippen
(overlappende klein segmenten)
Elke klein segment sequencen met PCR
Overlap tussen de kleine segmenten vinden waar de
sequenties gelijk zijn (contig)
Steeds grotere stukjes overlappen totdat alle segmenten
gekoppeld zijn (lukt meestal niet! gaten)
Truc om overlap te creëren zonder genenkaart:
Circulation adapters aan uiteinde van DNA fragment ligeren
(20, 8 of 3 kb)
Adapters aan elkaar cirkelvormig DNA molecuul
Dit cirkelvormig DNA molecuul wordt in stukjes geknipt en
selecteer de stukjes met de ‘circulization adapters’
Afstand tussen de rode stukjes is dus 20, 8 of 3 kb
Adapters A en B aan de eindes van het fragment ligeren
Fragmenten met adapters amplificeren met PCR
Kijken of je de gaten op kunt vullen met de paired-end reads
The Institute for Genomic Research was binnen een jaar klaar met
sequencen van het genoom
Veel minder genen bij de mens dan gedacht
Het humane genoom is van iedereen en de private sector moet dus haar data delen
Volledige genoom was in 2003 klaar
Goedkopere technologieën hebben kortere reads en maken meer foutjes
Met goedkopere technologieën moet je dus vaker dieper sequencen (elke base vaker sequencen)
Technologieën en prijzen veranderen elk jaar
Gen annotatie: de samenstelling van het gen bepalen
EST: eindes van het coderende stuk van het gen
