Samenvatting Biomethoden
Bij het vak biomethoden komen verschillende onderwerpen uitgebreid aan bod. In 7 lessen zal
aandacht besteed worden aan qPCR (opzet MRD experiment, RNA-isolatie, dCt, ddCt en PFAFFL
methode), fluorescentie microscopie, HPLC, GC, MS/LC-MS, SDS-PAGE en capillair electroforese.
Inhoudsopgave
Leeruitkomsten:.....................................................................................................................................2
RNA (Ribonucleïnezuur)......................................................................................................................3
cDNA synthese....................................................................................................................................5
Termen en uitwerking RT-PCR............................................................................................................6
3 manieren van uitwerken real-time..................................................................................................7
Huishoudgenen...............................................................................................................................8
Rekenen met de ∆Ct, ∆∆Ct en Pfaffl methode................................................................................8
Fluorescentie..........................................................................................................................................9
Fluorescentie microscoop...............................................................................................................9
Fluorescent in situ hybridization (FISH)............................................................................................10
Chromatografie....................................................................................................................................10
Vloeistofchromatografie...................................................................................................................10
High Performance Liquid Chromatografie (HPLC).............................................................................11
Massaspectrometrie (LC-MS)...........................................................................................................11
Mass analyzer...............................................................................................................................13
Tandem Massa Spectrometrie (MS/MS)...........................................................................................14
XLC-MS/MS.......................................................................................................................................14
Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS)........................................................................14
Massa spectrum...............................................................................................................................14
Elektroforese........................................................................................................................................15
Capillair elektroforese......................................................................................................................15
Weergave binnenkant capillair.....................................................................................................17
Eiwit elektroforese...........................................................................................................................17
SDS-PAGE..........................................................................................................................................17
,Leeruitkomsten:
de basis principes van een RNA isolatie benoemen en de kwaliteit van een RNA monster
vaststellen en beargumenteren
de reverse transcriptase reactie beschrijven en aangeven wat de functie van de
verschillende componenten is
de verschillende methodes van een qPCR uitleggen, de vereiste controles benoemen en
de meest geschikte analyse methode kiezen en de keuze onderbouwen
de principes van fluorescentie vertellen, een schematisch overzicht geven van een
fluorescentie microscoop en hierin de onderdelen benoemen en de verschillende stappen van
het FISH experiment benoemen en verklaren
de schematische opbouw van een LC-MS geven, aangeven welke soorten ionisator en detector
er bestaan en benoemen wat de voor- en nadelen van elk zijn
de verschillende componenten van een HPLC en GC systeem benoemen, en toepassingen van
beide systemen binnen de medische diagnostiek kunnen geven
de (capillair) elektroforese techniek uitleggen, en de belangrijkste termen uitleggen (stacking,
EOF, u). Ook kan de student manieren om de EOF te beïnvloeden geven
,MDR Experiment
Minimal residual disease (MRD) is het minimale aantal tumorcellen nodig om een terugkeer van de
ziekte (relapse) te krijgen.
Het doel van het experiment is het bepalen van het aantal BCR-ABL translocatie houdende cellen
(K562 cellijn) in een monster te bepalen. Dit met behulp van real-time PCR en de Pfaffl methode door
de genexpressie van het BCR-ABL translocatie te vergelijken met de expressie van het GAPDH gen.
Voor de proef wordt de K562 cellijn gebruikt, deze cellijn is een tumorcellijn welke veel mutaties in
het genoom heeft. Een kenmerkende mutatie van de cellijn is het Philadelphia chromosoom, welke is
ontstaan door een translocatie van het Abl proto-oncogen van chromosoom 9 is verplaatst naar
chromosoom 22 en is gefuseerd. Naast Philadelphia chromosoom wordt deze translocatie het meest
weergegeven als BCR-ABL translocatie.
Naast de K562 cellen worden als referentie cellen, de HL60 cellijn gebruikt. Deze cellen bevatten het
BCR-ABL translocatie niet maar worden gebruikt voor de genexpressie van GAPDH. Het GAPDH is het
huishoud gen waarmee de expressie van BCR-ABL wordt vergeleken.
RNA (Ribonucleïnezuur)
Het centrale dogma
Met het centrale dogma worden de aanwezige genen bedoelt die coderen voor eiwitten. Door
middel van transcriptie en translatie worden de sequenties omgezet tot eiwitten.
Een RNA-monomeer bestaat uit een ribose, een base en fosfaat. Basen: A, C, G, U.
Er bestaan verschillende soorten RNA:
Messenger RNA (mRNA)
Het mRNA draagt genetische informatie voor een proteïne van het DNA naar
het ribosoom. Het mRNA is een complementaire copy van een DNA gen.
Ribosomal RNA (rRNA)
rRNA is het structurerend en functionerend component van een ribosoom. Het
grote subunit bestaat uit 2 strands rRNA en 34 proteïnen, de kleine subunit bestaat uit 1 strand
rRNA en 21 proteïnen.
Transfer RNA (tRNA)
tRNA transleert de genetische code van het mRNA in een aminozuur sequentie. Het tRNA draagt
een specifiek gebonden aminozuur bij zich, wat complementair is aan een codon op het mRNA.
viraal RNA (ssRNA)
,Het isoleren van RNA
Waarom RNA isoleren? Van mRNA is cDNA te maken en kan zo gebruikt worden voor PCR. Het
isoleren van RNA is nodig specifiek kijken naar de genen die tot expressie komen.
Wat doet RNase? RNase is een enzym dat RNA afbreekt door dit op te breken in kleine stukken.
Protocol TRIzol Reagent/ RNA Solv. Reagent
RNA wordt geïsoleerd met behulp van TRIzol of RNA Solv. Reagent. Het is een monofase oplossing
bestaande uit fenol en guanidine isothyocyanate.
1. Fenol zorgt samen met guanidine isothycocyanate voor lysis van de cel. Hiermee komt het RNA
vrij.
- Guanidine isothycocyanate is ook beschermend tegen RNases.
2. Het toevoegen van chloroform resulteert in een fasescheiding: waterig, organische en
tussenfase.
- In de waterige fase bevind zich het RNA.
- Tussenfase bevat DNA
- Organische fase bevat eiwitten en lipiden.
3. Met isopropanol slaat het RNA neer, na centrifuge ontstaat een RNA pellet.
4. Het RNA vervolgens wassen met alcohol (verwijderen TRIzol) en laten drogen
5. Gedroogde RNA pellet wordt geresuspendeerd in DEPC behandeld water
Waar op te letten:
Fenol is zuur. Wanneer de oplossing oud is kan de pH veranderen. Wanneer de oplossing meer base
is wordt het RNA minder goed gescheiden.
Naast isolatie met fenol, kan RNA kan ook geïsoleerd worden met kolommen (filters of beads, kit). Dit
is vaak meer zuiver.
Agarose gelelektroforese
Concentratie en grootte RNA meten. Door middel van agarose gelelektroforese is de kwaliteit van het
RNA . Dit met gebruik van DNA of RNA gel. RNA gel maak je gebruik van een semidenaturerende gel.
Nanodrop (UV spectroscopy)
Een Nanodrop is een spectrofotometer waarbij de absorpie van licht wordt gemeten door een
sample. Hoe hoger de gemeten absorptie, hoe hoger de concentratie in het sample. Dit berust op de
wet van Lambert-Beer: A = E * c * l.
De Nanodrop heeft bereik in het UV-gebied 180-380 nm.
Bij de verschillende golflengtes worden de volgende stoffen gemeten:
230 nm Alle verontreinigingen, organische stoffen (suikers, zouten)
260 nm DNA en RNA, meten van nucleïnezuren
280 nm Eiwitten
320 nm Achtergrond correctie voor meten van puurheid DNA en RNA
Wat vertelt de A260/A280 ratio?
De ratio geeft inzicht in het type nucleïnezuur dat aanwezig is (dsDNA of RNA) en geeft een ruwe
indicatie van de zuiverheid. Een ratio tussen 1,8 en 2,2 wordt gezien als goed.
Een waarde onder 1,8 duid op de aanwezigheid van veel eiwitten. Een ratio hoger dan 2 betekend
dat er veel geabsorbeerd word.
,De ratio wordt beïnvloed door de pH. Een hogere pH leidt tot denaturatie van eiwitten en hiermee
een verlagende A280. A260 blijft gelijk en hierdoor verhoogd de 260/280 ratio. Een andere invloed
van de ratio is het fenol, wat wordt geabsorbeerd bij 270 nm, het is daarom van groot belang dat er
goed gewassen wordt na isolatie!
Naast RNA wordt ook DNA en vrije nucleotiden gemeten.
(Tabel 2.3: absorptie van nucleïnebasen)
cDNA synthese
Om mRNA te kunnen analyseren op genexpressie via PCR is de synthese naar complementair DNA
(cDNA) nodig. Want het SYBR-green kan alleen binden aan dubbelstrengs DNA.
Stoffen nodig in het reactiemengsel:
Primers, waarbij Oligo(dT) primers de voorkeur hebben
DEPC-water, RNase vrij water
dNTP’s
Reverse transcriptase (M-MLV RT)
5x first strand buffer, met tris-HCl buffer (pH 8,3), KCl en MgCl (co-factor enzym)
o DiThioThreitol, verbreekt de secundaire structuur van DNA en legt het plat neer
o RNase inhibitor, tegengaan van RNase
RNase OUT , Ribonuclease remmer werkend tegen RNase A, B en C.
RNA template
Verschillende primers voor de synthese van cDNA:
Random hexameren (2-staps)
Bestaande uit willekeurige sequenties van 6 nucleotiden lang. De primers binden op verschillende
plekken op het mRNA. Na synthese is er altijd iets meer cDNA, daardoor kan het lijken dat er meer
gen expressie is.
Oligo dT primer (2-staps)
Binden specifiek aan de poly-A-staart van het mRNA.
Gen specifieke primers (1-stap)
Primer voor een gen van interesse, het cDNA wordt geamplificeerd
Superscript III reverse transcriptase
Hetzelfde als M-MLV RT maar heeft een verbeterde thermo stabiliteit, kan tegen hogere
temperaturen en heeft een verminderde RNAseH activiteit. RNAseH is een enzym dat er voor zorgt
dat de mRNA streng wordt verwijderd bij de gevormde RNA/DNA hybride.
Naast een negatieve controle (geen DNA) is er ook een -RT controle: alles in behalve het RT.
Real-time PCR
Tijdens de Real-Time PCR wordt het gesynthetiseerde cDNA geamplificeerd waarbij er ondertussen
fluorescentie wordt gemeten. Deze fluorescentie staat in verhouding tot de hoeveelheid
geamplificeerd product.
, Stappen van PCR:
De stappen vormen 1 cyclus en is het DNA verdubbeld. Elke cyclus is daarmee n 2.
1. Denaturatie, 95 graden Celcius.
Waterstofbruggen tussen dubbelstrengs DNA verbreken, er ontstaat enkelstrengs DNA.
2. Annealing, temperatuur verlaagd naar 40-60 graden Celsius.
Primers binden aan het enkelstrengs DNA.
- Annealing temperatuur is de smelttemperatuur van de primers (T m) - 5 graden celsius.
3. Elongatie, verhoging temperatuur tot 72 graden Celsius
Taq-polymerase plaatst de dNTP’s en vormt complementaire strengen. Er is amplificatie van
product.
Magnesium concentratie en annealing temperatuur kunnen aangepast worden.
SYBR green vs Taqman
SYBR green Taqman probe
Bind specifiek aan minor-groove van Er wordt een probe gebruikt specifiek voor het
dubbelstrengs DNA, dus ook aan mogelijk te amplificeren stuk
gevormde primer-dimers Taqman wordt door polymerase tijdens
elongnatie afgeknipt, er ontstaat fluorescentie
Reactiemengsel PCR
Reagentia [stock] Rxn- Verdunning Voor 1 Voor n+1
concentraties reactie (50 reachties
in 50 ul ul) N=30
H2O - - 38,6 1196,6
PCR rxn 10x 1x 10x 5 155
dNTP’s 25 mM each 250uM 100x 0,5 15,5
Primer F 25 mM 0,5 uM 50x 1 31
Primer R 25 mM 0,5 uM 50x 1 31
MgCl2 50 mM 1,5 mM 33,33x 1,5 46,5
Taq pol. 5 U/ul 0,04 U/ul 125 x 0,4 12,4
Template 25 ng/ul 1 ng/ul 25x 2 62
Template wordt later toegevoegd! Deze behoord niet in de mastermix.
dNTP’s stock, nodig 15,5 ul 25 mM dNTP
Reagentia [stock] Rxn Verdunning Voor reactie: 20 ul
concentraties
in 20 ul
dATP 100 mM 25 mM 4x 5
dCTP 100 mM 25 mM 4x 5
dGTP 100 mM 25 mM 4x 5
dTTP 100 mM 25 mM 4x 5
Termen en uitwerking RT-PCR
Baseline, achtergrond/ ruis. Er is nog niet een echt signaal, de eerste cycli van de run.
