SAMENVATTING ONDERDEEL SEQUENCING EN TRANSCRIPTOMICS
1. Principe van Sanger en NGS sequencing
technieken
Sequencing kan gebruikt worden in:
Genoom
o De complete genetische samenstelling van een organisme, cel of virus
Transcriptoom
o Alle RNA moleculen in een cel of populatie cellen
Het duurt ongeveer 13 jaar om het gehele menselijke genoom te sequencen met een automated
Sanger sequencer
1.1 Sanger sequencing
Eerste generatie sequencing (Sanger)
Ontwikkeld in 1977 door Frederick Sanger
Er is een (klein) stukje puur klonaal DNA voor nodig
Je kan maar 1 clone per reactie sequencen
Read lengte ~500-1000 bp
Vroeger: tijdrovend en arbeidsintensief
Waarom is de maximale lengte van een Sanger read ~1000 bp
o Grotere fragmenten zijn op een polyacrylamide gel niet goed te scheiden.
o De amplitude van het signaal neemt af vanwege het afnemende aantal moleculen
van langere lengte
Shotgun sequencing:
Sequensen van random stukken DNA waarbij er uit overlap een consensussequentie wordt
bepaald
Twee types:
o Hierarchical shotgun sequencing
Genoom eerst in grote stukken
o Whole genome shotgun sequencing
Genoom gelijk in kleinere stukken
Het voornaamste verschil tussen de 2 strategieën is vooral een verschil in benodigde
computerkracht
Basen identificeren, hoe zat dat bij Sanger?:
Eindpunt polymerisatiereactie
Reactie gestopt op alle basenposities door dideoxynucleotiden
Basen worden geïdentificeerd d.m.v. elektroforese
1.2 Next generation sequencing
De basisprincipes van Next generation sequencing:
Sanger: één fragment tegelijk per reactie
NGS: een groot complex mengsel van random fragmenten per reactie
1
, Truc #1: ruimtelijke scheiding:
Het scheiden van DNA fragmenten door verankering.
Voorbeeld 1:
o Clonal Bridge Amplification (Illumina)
o Wat gebeurt er met het originele template in clonal bridge amplification?
Het wordt na de eerste amplificatie weggewassen
Voorbeeld 2: emulsion PCR (o.a. Ion Torrent)
o
Truc #2: real-time sequencing:
Sequncing by synthesis (SBS) real time sequencing
Identificeer de basen op het moment dat ze worden geïncorporeerd door de polymerase
o Oftewel je krijgt elke stap informatie over je base
Toegepast om te identificeren bij NGS
Kan gebruikt worden in:
Genomics:
o Opsporen van mutaties (Variantanalyse)
o Sequencing van nieuwe genomen (de novo sequencing)
o Identificatie van organismen in een bepaalde biotoop (Metagenomics)
o Identificeren van mensen en verwantschap (DNA profiling)
Transcriptomics:
o Expressieanalyse (RNA-seq)
o Expressie regulatie analyse (Small RNA-seq/non-coding RNA sequencing)
o Opsporen van ziekten (exRNA-seq)
1.3 NGS dataverwerking
NGS Dataverwerking:
1. Re-sequencing
Doe een alignment van alle sequenties tegen een bekend referentiegenoom
2. De novo assembly
Gebruik de overlap tussen de fragmenten om een nieuwe consensus sequentie te
assembleren
Overzicht dataverwerking:
1) Re-sequencing
+ snelheid
+ kleine verschillen worden makkelijk opgepikt
- je hebt een bestaande referentie nodig
- reads die niet mappen worden niet gebruikt (je mist dus nieuwe informatie)
2
1. Principe van Sanger en NGS sequencing
technieken
Sequencing kan gebruikt worden in:
Genoom
o De complete genetische samenstelling van een organisme, cel of virus
Transcriptoom
o Alle RNA moleculen in een cel of populatie cellen
Het duurt ongeveer 13 jaar om het gehele menselijke genoom te sequencen met een automated
Sanger sequencer
1.1 Sanger sequencing
Eerste generatie sequencing (Sanger)
Ontwikkeld in 1977 door Frederick Sanger
Er is een (klein) stukje puur klonaal DNA voor nodig
Je kan maar 1 clone per reactie sequencen
Read lengte ~500-1000 bp
Vroeger: tijdrovend en arbeidsintensief
Waarom is de maximale lengte van een Sanger read ~1000 bp
o Grotere fragmenten zijn op een polyacrylamide gel niet goed te scheiden.
o De amplitude van het signaal neemt af vanwege het afnemende aantal moleculen
van langere lengte
Shotgun sequencing:
Sequensen van random stukken DNA waarbij er uit overlap een consensussequentie wordt
bepaald
Twee types:
o Hierarchical shotgun sequencing
Genoom eerst in grote stukken
o Whole genome shotgun sequencing
Genoom gelijk in kleinere stukken
Het voornaamste verschil tussen de 2 strategieën is vooral een verschil in benodigde
computerkracht
Basen identificeren, hoe zat dat bij Sanger?:
Eindpunt polymerisatiereactie
Reactie gestopt op alle basenposities door dideoxynucleotiden
Basen worden geïdentificeerd d.m.v. elektroforese
1.2 Next generation sequencing
De basisprincipes van Next generation sequencing:
Sanger: één fragment tegelijk per reactie
NGS: een groot complex mengsel van random fragmenten per reactie
1
, Truc #1: ruimtelijke scheiding:
Het scheiden van DNA fragmenten door verankering.
Voorbeeld 1:
o Clonal Bridge Amplification (Illumina)
o Wat gebeurt er met het originele template in clonal bridge amplification?
Het wordt na de eerste amplificatie weggewassen
Voorbeeld 2: emulsion PCR (o.a. Ion Torrent)
o
Truc #2: real-time sequencing:
Sequncing by synthesis (SBS) real time sequencing
Identificeer de basen op het moment dat ze worden geïncorporeerd door de polymerase
o Oftewel je krijgt elke stap informatie over je base
Toegepast om te identificeren bij NGS
Kan gebruikt worden in:
Genomics:
o Opsporen van mutaties (Variantanalyse)
o Sequencing van nieuwe genomen (de novo sequencing)
o Identificatie van organismen in een bepaalde biotoop (Metagenomics)
o Identificeren van mensen en verwantschap (DNA profiling)
Transcriptomics:
o Expressieanalyse (RNA-seq)
o Expressie regulatie analyse (Small RNA-seq/non-coding RNA sequencing)
o Opsporen van ziekten (exRNA-seq)
1.3 NGS dataverwerking
NGS Dataverwerking:
1. Re-sequencing
Doe een alignment van alle sequenties tegen een bekend referentiegenoom
2. De novo assembly
Gebruik de overlap tussen de fragmenten om een nieuwe consensus sequentie te
assembleren
Overzicht dataverwerking:
1) Re-sequencing
+ snelheid
+ kleine verschillen worden makkelijk opgepikt
- je hebt een bestaande referentie nodig
- reads die niet mappen worden niet gebruikt (je mist dus nieuwe informatie)
2
