Practicum Moleculaire Biologie
(PMOB)
Life Sciences – Hogeschool Utrecht
Semester 6
PCR amplificatie van het cDNA van de glucocorticoïde
receptor + zuivering
Stap in het gehele proces
Doel
Het doel van dit practicum is het ampliciferen van het cDNA van de glucocorticoïde receptor met behulp van PCR.
Materiaal & Methode
Bij het uitvoeren van dit practicum wordt gebruik gemaakt van protocol 1, te vinden op Canvas.HU.nl
en onder het mapje 'Protocollen' in het Labjournaal.
Materiaal
Dag 1
- 10x PCR buffer
- dNTP mix, 10 mM per dNTP
- Primers, ieder 5 uM
GRcloningFW21: 5’ ACTATTCTCGAGGCCACCATGGACTCCAAAGAATCCTTAGC 3’
GRcloningRV21: 5’ ACTATTCCGCGGTTGATGAAACAGAAGCTTTTTGATATTTC 3’
- p6RGR plasmide, 10 ng/ul
- Taq polymerase (5 units/uL)
- PCR reactievaatjes
Dag 2
- Buffer BP
- QIAQuick kolom
- Buffer PE
- Buffer EB
Methode
De stappen van het protocol werden uitgevoerd zoals voorgeschreven.
,Eerst werden de reactie mengsels bereid waarbij een negatieve controle zonder plasmide DNA
werden meegenomen. Daarna werden de monsters van de groep verzameld en tegelijkertijd in het
PCR apparaat geplaatst. Deze werd aangezet op het aangegeven programma.
Het principe van de PCR methode berust op het cyclisch verwarmen en afkoelen van de PCR mix,
zodat het gewenste DNA in een relatief korte tijd tot een groot aantal geamplificeerd wordt. Door te
verwarmen en af te koelen wordt ervoor gezorgd dat het DNA steeds enkelstrengs wordt
(denaturation), dat er specifieke primers kunnen binden (annealing) en dat DNA polymerase met
behulp van de toegevoegde dNTP's het doel DNA kan amplificeren (elongation).
Bij het maken van de reactie mengsels werd onderstaand pipetteerschema 1 gevolgd. Hierbij werd
voldoende gemaakt voor 5 PCR reacties.
Tabel 1: pipetteerschema voor het maken van de basisreactiemix voor 5 PCR reacties.
Pipetteerschema 2 voorbeeld voor 1 basisreactiemix.
Berekening van de reactimix:
Om 1x PCR buffer te krijgen in plaats van 10x, moest de oplossing 10 keer verdund worden. De
eindconcentratie is 25 ul, dus er moet 25/10= 2,5 ul 10x PCR buffer worden toegevoegd.
De dNTP’s moesten 50 keer verdund worden (200 uM/ 10.000uM = 50x). Er moest dus 25/50 = 0,5 ul
van de dNTP mix worden toegevoegd.
De primers moesten 10 keer verdund worden (500 nM/ 5000 nM = 10x). Er moest dus 25/10 = 2,5 ul
per primer worden toegevoegd.
Van de Taq polymerase was 1 unit per reactiemix nodig. De stockoplossing was 5 units per ul. Er is
dus 1ul/5 = 0,2 ul van de Taq polymerase nodig per reactiemix.
Nadat de basisreactiemix was gemaakt, werden de uiteindelijke reactiemixen gemaakt voor zowel de
monsters als de negatieve controle. Het pipetteerschema van de reactiemix voor de monsters is
weergegeven in tabel 3 en het pipetteerschema van de reactiemix voor de negatieve controle is
weergegeven in tabel 4.
Tabel 3: pipetteerschema voor de complete mix voor 2 PCR reacties voor de monsters. Hierbij werd
een overmaat gemaakt (3 monsters gerekend).
,Tabel 4: pipetteerschema voor de negatieve controle zonder template DNA.
Na pipetteren konden de PCR mixen in het PCR apparaat gezet worden. Hierna werd het aangegeven
programma aangezet zoals aangegeven in protocol 1.
Op dag 2 kon het PCR product gezuiverd worden. Dit werd gedaan door gebruik te maken van de
QiaQuick Spin methode, waarmee een speciale kolom het PCR product scheidt van de PCR buffer bij
het spoelen met verschillende buffers. Het PCR product kan dan aan het einde van de wasstappen
geëlueerd worden van de kolom, waarmee de zuivering compleet was.
Veiligheid
Tijdens het uitvoeren van het practicum werden de veiligheidsregels van het ILC in acht genomen.
Daarnaast werd het afval in de juiste afvalbakken gescheiden.
Bij het gebruiken van de volgende stoffen werd extra op de veiligheid gelet, omdat deze risico met zich
mee brengen.
- 50x TAE
Deze stof is schadelijk voor gezondheid (GHS07) en milieu (GHS09).
H-zinnen: H315, H317, H319, H410
P-zinnen: P261, P264, P273, P280, P302, P352, P305, P351, P338
- Sybr safe stain
Schadelijk voor de huid, dus bij gebruik moeten handschoenen gedragen worden en moet in de
zuurkast gewerkt worden
- Isopropanol
Schadelijk voor de gezondheid en ontvlambaar
H-zinnen: H225, H319, H336
P-zinnen: P210, P243, P280, P304+P340, P305+P351+P338
Resultaten
De resultaten van de PCR producten konden later bekeken worden op het moment dat de agarose gel
elektroforese werd uitgevoerd. Deze resultaten zijn beschreven bij 'Restrictie digest van het PCR product en het
pEGFP-Nx plasmide + elektroforese'
Conclusies
De conclusie met betrekking tot de resultaten zal later beschreven worden bij 'Restrictie digest van het PCR
product en het pEGFP-Nx plasmide + elektroforese'
Voorstellen voor verbetering
Voor dit practicum zijn geen voorstellen voor verbetering of discussiepunten.
,Restrictie digest van het PCR product en het pEGFP-Nx
plasmide + elektroforese
Stap in het gehele proces
Doel
Het doel van dit practicum is het knippen van pEGFP-Nx plasmide en het PCR product, door middel
van XhoI en SacII restrictie enzymen, zodat hier een insert GR in geplaats kan worden.
Verwachting
De verwachting is dat de PCR producten op een hoogte van 2385 bp liggen en de plasmides die geknipt zijn met
beide enzymen rond de 4700 bp. De geknipte plasmiden met 1 enzym zou één bandje moeten laten zien en de
ongeknipte meerdere bandjes. De negatieve controle zou geen banden moeten laten zien, omdat hier geen DNA
aan toegevoegd is.
Materiaal & Methode
Bij het uitvoeren van dit practicum wordt gebruik gemaakt van protocol 2 en 3, te vinden op
Canvas.HU.nl en onder het mapje 'Protocollen' in het Labjournaal.
Materiaal
Protocol 2
-PCR product (gezuiverd, protocol 1)
- pEGFP-Nx plasmide (200 ng/uL)
- Buffer H, 10x (Promaga)
- Restrictie enzymen; SacII Xhol (10 units/uL)
Protocol 3
-Agarose
- 50X TAE
- DNA monsters (protocol 2)
- Sybr safe stain
- Lambda/PstI marker
- Agarose gel loading buffer, 5X
,- QG buffer
- Isopropanol
- QIAquick kolom
- PE buffer
Methode
De stappen van het protocol werden uitgevoerd zoals voorgeschreven.
De monsters die tijdens dit experiment onderzocht worden;
- pEGFP-Nx plasmide met XhoI en SacII
- pEGFP-Nx plasmide ongeknipt
- pEGFP-Nx plasmide geknipt met XhoI
- pEGFP-Nx plasmide geknipt met SacII
- PCR reactie met XhoI en SacII
Het pipetteerschema wat werd gebruikt tijdens dit onderzoek is weergegeven in tabel 1.
Pipetteerschema 1: reactiemengsel voor 6 monsters.
Voorbeeld berekening voor de reactie met geknipt plasmide:
Buffer H heeft een stockconcentratie van 10X. Er is een concentratie van 1X nodig, 10x verdund dus, in een
totaalvolume van 20 uL. 20/10 = 2, dus er wordt 2 uL genomen van de buffer H oplossing zodat deze hiermee 10
keer verdund wordt.
XhoI heeft een stockconcentratie van 10 Units/uL. Er is een concentratie van 10 Units nodig in 20 uL. Omdat in 1
uL 10 Units zitten bij de stockoplossing, wordt er dus 1 uL van genomen voor de reacite.
Hetzelfde geldt voor de SacII, welke dezelfde stockconcentratie heeft en dezelfde eindconcentratie moet hebben.
Tijdens het incuberen met de restrictie enzymen kon de agarose gel gemaakt worden voor de
elektroforese.
Bij de elektroforese werden de geïncubeerde monsters van loading buffer voorzien en in de gel
geladen. Daarna werd voor 30-60 minuten bij 120 V de elektroforese uitgevoerd. De elektroforese
methode wordt toegepast om DNA fragmenten te scheiden op basis van grootte. Door de gel onder
spanning te zetten, zullen de negatief geladen DNA fragmenten zich van de negatief geladen anode
naar de positieve kathode aan de overkant van de gel bewegen. Doordat de agarose gel weerstand
biedt, zullen kleine DNA fragmenten eerder bij de kathode aankomen dan grote DNA fragmenten.
Hiermee worden grote en kleine DNA fragmenten van elkaar gescheiden.
Wanneer de gel elektroforese uitgevoerd was, konden de resultaten bekeken worden en konden de
gewenste DNA fragmenten uit de agarose gel gesneden worden. Na afwegen werd het DNA uit de gel
geïsoleerd met behulp van de QIAquick Gel Extraction Kit, welke volgens hetzelfde principe werkt als
het zuiveren van het PCR product.
,Veiligheid
Tijdens het uitvoeren van het practicum werden de veiligheidsregels van het ILC in acht genomen.
Daarnaast werd het afval in de juiste afvalbakken gescheiden.
Bij het gebruiken van de volgende stoffen werd extra op de veiligheid gelet, omdat deze risico met zich
mee brengen.
- 50x TAE
Deze stof is schadelijk voor gezondheid (GHS07) en milieu (GHS09).
H-zinnen: H315, H317, H319, H410
P-zinnen: P261, P264, P273, P280, P302, P352, P305, P351, P338
- Sybr safe stain
Schadelijk voor de huid, dus bij gebruik moeten handschoenen gedragen
Resultaten
De verschillende reacties na restrictie digestie van de PCR producten werden op de agarose gel
geëlektroforeerd waarvan hieronder het resultaat te zien is. Daarin zijn ook de verschillende controles
meegenomen.
Figuur 1: resultaten gel elektroforese.
Slotje 1 = DNA maker;
slotje 2 = PCR product Student A;
slotje 3= PCR product Student B;
slotje 4 = plasmide geknipt Student A;
slotje 5= plasmide geknipt Student B;
slotje 6= plasmide ongeknipt;
slotje 7 = plasmide geknipt met alleen XhoI;
slotje 8 = plasmide geknipt met alleen SacII;
slotje 9 = leeg;
slotje 10 = PCR controle Student A;
slotje 11 = PCR controle Student B;
slotje 12 = leeg;
slotje 13 = DNA marker;
slotje 14 en 15 = leeg.
In slotje 2 en 3 zitten de PCR producten. Deze hebben een grootte van ongeveer 2500-3000 bp.
In slotje 4 en 5 zitten de geknipte plasmiden. Deze hebben een grootte van ongeveer 4000-5000 bp.
In slotje 6 zit het ongeknipte plasmide. Hierbij zijn meerdere bandjes te zien net als in slotje 8 bij de
geknipte plasmide met SacII.
In slotje 7 zit de plasmide die geknipt is met XhoI. Hierbij is 1 bandje te zien ter hoogte van ongeveer
4000-5000 bp.
,In de slotjes waar meerdere banden te zien zijn zitten waarschijnlijk circulaire deeltjes DNA en in de
slotjes waar 1 bandje te zien is lineaire.
In slotje 10 en 11 is de negatieve controle te zien. Hierbij zijn geen bandjes zichtbaar.
NB: door afwezigheid van deze les i.v.m. ziekte zijn de resultaten van medestudent Student A en
Student B overgenomen.
Resultaten inhaal les
In figuur 2 is het resultaat te zien van de restrictie digestie welke tijdens de inhaal les is uitgevoerd.
Hierbij zijn alleen de plasmiden geknipt met XhoI en SacII. De PCR producten waren toen nog niet
voldoende gevormd om ook mee te nemen in de gel.
Figuur 2 Resultaat gel elektroforese inhaal les
De volgorde van de slotjes is daarbij;
Slotje 1: Lambda/PstI marker
Slotje 2: pEGFP-Nx plasmide geknipt met XhoI en SacII
Slotje 3: pEGFP-Nx plasmide ongekniot
Slotje 4: pEGFP-Nx plasmide geknipt met XhoI
Slotje 5: pEGFP-Nx plasmide geknipt met SacII
Er is te zien dat in slotje 2 met het geknipte plasmide (zowel XhoI en SacII) twee bandjes laat zien.
In slotje 3 met ongeknipt plasmide is een bandje te zien die wat smeer heeft.
In slotje 4 en 5 waarin één restrictie enzym aan het plasmide is toegevoegd, zijn wel twee duidelijke
slotjes te zien op dezelfde hoogte.
Deze resultaten zijn verder niet meegenomen voor de volgende practica.
, Conclusie
De verwachting was dat bij de plasmide een bandjesgrootte van ongeveer 4700 bp te zien zou zijn en
bij de PCR producten een bandjesgrootte van 2385 bp te zien zou zijn. Wanneer er naar figuur 1
wordt gekeken kan worden geconcludeerd dat dit inderdaad het geval is.
Verder was de verwachting dat het ongeknipte plasmide meerdere bandjes zou laten zien in de gel.
In figuur 1 is te zien dat de ongeknipte plasmide inderdaad meerdere bandjes laat zien. De
verwachting is dat de plasmide die met 1 restrictie-enzym is geknipt 1 bandje laat zien op ongeveer
dezelfde hoogte als de geknipte met beide enzymen (4700 bp). De plasmide die geknipt is met XhoI
(slotje 7) laat 1 bandje zien zoals verwacht werd, maar de plasmide die geknipt is met alleen SacII
(slotje 8) laat meerdere bandjes zien. Dit was niet de uitkomst die verwacht werd.
Tot slot is te zien dat de negatieve controles geen bandenpatroon laat zien. Dit was ook de
verwachting.
De conclusie die er nu getrokken kan worden op basis van de resultaten is dat XhoI in ieder geval
geknipt heeft en dat het niet zeker is of SacII optimaal geknipt heeft of niet. Het zou in theorie dus
kunnen dat het geknipte plasmide alleen geknipt is met XhoI.
Conclusie inhaal les:
Omdat in figuur 2 bij het geknipte plasmide met zowel XhoI als SacII twee bandjes te zien zijn, kan
niet geconcludeerd worden dat het plasmide volledig geknipt is. Doordat er een tweede bandje te zien
is tussen de bandjes van wel geknipt en ongeknipt (slotje 2 en 3), lijkt het erop dat niet al het plasmide
volledig geknipt is.
Omdat de twee bandjes in slotje 4 en 5 op dezelfde hoogte liggen en allebei duidelijk zijn, kan wel
geconcludeerd worden dat beide enzymen functioneel zijn.
Discussie
Zoals in de conclusie is besproken komt de uitkomst van de plasmide die alleen geknipt is met SacII
niet overeen met wat de verwachting was. Dat er meerdere bandjes te zien zijn op de afbeelding
onder slotje 8 zou kunnen komen doordat het plasmide niet volledig geknipt is met het SacII enzym.
Het resultaat van het plasmide wat geknipt is met alleen SacII (slotje 8) komt overeen met het
resultaat van de ongeknipte plasmide (slotje 6).
Wanneer er na de andere protocollen die nog worden uitgevoerd er een slecht resultaat uit gaat
komen zou dat kunnen komen doordat SacII dus niet optimaal geknipt heeft.
Als dit protocol herhaald zou worden, kan er eventueel gekeken worden naar de kwaliteit van de SacII
restrictie enzymen. Mogelijk zijn deze verminderd in kwaliteit door te lang laten staan, waardoor ze
functie verliezen. Ook zou er langer geïncubeerd kunnen worden met de restrictie enzymen waardoor
er mogelijk meer plasmide geknipt wordt.
Discussie inhaal les:
Er kan niet met zekerheid vastgesteld worden dat het volledige plasmide geknipt is met zowel XhoI als
SacII, omdat in slotje 2 twee bandjes te zien zijn. Mogelijk is er niet lang genoeg geïncubeerd met de
restrictie enzymen. De kwaliteit van de enzymen is namelijk wel voldoende, zo blijkt uit slotje 4 en 5
die twee duidelijke bandjes laten zien.
