Naam: Miranda Seegers
Datum uitvoering: 3 en 10 oktober 2018
Datum verslag: 20 oktober 2018
Docent: Trusanne Bos
Zetmeel omzetten in glucose en vervolgens
fermenteren naar bio ethanol.
Samenvatting
Met dit experiment is zetmeel omgezet in glucose met behulp van alfa-amylase en amyloglucosidase
waarna vervolgens glucose is gefermenteerd naar bioethanol door het toevoegen bakkergist.
Doormiddel van het gewichtsverlies is een rendement berekend van 62,41% (m/m). doormiddel van
de afname in de glucose concentratie tijdens de fermentatie is een rendement berekend van
100,70% (m/m), dit ligt boven de grens van 100% aangezien er een slechte r^2 verkregen werd met
de kalibratielijn. Het percentage ethanol na centrifugeren bedroeg 72,43%, dit zou verhoogt kunnen
worden (tot max 96%) doormiddel van destillatie.
Doel
In het eerste dagdeel van dit verslag wordt zetmeel omzetten in glucose en vervolgens fermenteren
naar bioethanol op een manier die vergelijkbaar is met industriële productie van bioethanol. In het
tweede dagdeel wordt de glucose van vorige week gebruikt als nutriënt-koolstofbron voor
bakkersgist (Saccharomyces cerevisiae) in een ethanol fermentatie. Het fermentatieproces kan
gevolgd worden door het gewichtsverlies te bepalen in de tijd.
Inleiding
Dagdeel 1
In het eerste dagdeel zijn er 2 verschillende enzymen gebruikt (alfa-amylase en amyloglucosidase) dit
omdat zetmeel moleculen zo eerst in kleine stukjes worden geknipt met behulp van de alfa-amylase
waarna versuikering plaatsvind doormiddel van amyloglucosidase. Alfa-amylase van de bacillus
licheniformis werkt optimaal bij pH 6,9 op 20 graden celcius. Alfa-amylase splitst de alfa-(1,4)-
glycosidische bingen waardoor maltose, glucose en andere oligosachariden ontstaan. 1 2
Amyloglucosidase van de aspergiullus niger werkt optimaal bij ph 4,8 op 60 graden celcius (sigma
aldrich product nummer A3403). Amyloglucosidase is een exo-enzym. Amyloglucosidase van
Aspergillus niger is in staat om de α-D- (1-4), de α-D- (1-6) en de α-D- (1-3) glucosidebindingen van
oligosacchariden te hydrolyseren3
Er zal gestart worden met een zetmeel concentratie van 100 g/l om zo een detecteerbare
hoeveelheid ethanol te verkrijgen. Wanneer alfa-amylase aan het zetmeel is toegevoegd kan de
reactie in de gaten gehouden door een beetje van het reactiemengsel te pakken en deze met een
jodiumoplossing te laten reageren. Wanneer er geen zetmeel aanwezig is in de oplossing zal deze
rood/bruin worden. 1 unit alfa-amylae zal 1 mg maltose vrijmaken uit zetmeel in 3 minuten. We
starten met een zetmeel concentratie van 25 gram, er zal dus gebruik gemaakt moeten worden van
2500 units.
,Dagdeel 2
In het tweede dagdeel wordt gebruik gemaakt van de glucose die in het eerste dagdeel is gemaakt.
Deze zal dienen als macro-nutriënt tijdens de ethanol fermentatie met bakkersgist. Ethanol is een
primair metaboliet en zal dus vooral geproduceerd worden tijden de log-fase. De gist gebruikt
ethanol op ATP te generen in een zuurstofloze omgeving. De fermentatie is een anaeroob proces en
zal dus plaatsvinden met een waterslot en een wattenprop. De reactievergelijking voor deze
fermentatie zal zijn :C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 (+2 ATP). Tijdens deze fermentatie zal CO2 gas
ontstaan waardoor er dus gewichtsverlies optreed. Echter zal niet alle CO 2 ontsnappen, een deel zal
binden aan H2O. 1 mol glucose = 180 g, 2 mol CO2 = 88 dus 0,49 g gewichtsverlies per g glucose
(maar in praktijk zal dit dus niet plaatsvinden). De maximale opbrengst voor ethanol per gram
glucose is: 2 mol ethanol = 92 g, dus 0,51 g ethanol per g glucose. Echter zijn er in de praktijk ook veel
bijproducten zoals lactaat en azijnzuur. De gevormde ethanol kan uit het fermentatiemengsel kunnen
worden gehaald doormiddel van klaren (filtreren, centrifugeren en destillatie). Echter zal na
destillatie een azeotroop van ethanol en water ontstaan. 4
Tegenwoordig wordt er op grote schaal bioethanol geproduceerd voor toepassing als biobrandstof in
auto’s. Dit past binnen de transitie naar een biobased economy (=economie op basis van
biomaterialen in plaats van fossiele olie) om onze CO2 uitstoot te verkleinen. Als grondstof wordt
vaak gebruik gemaakt van zetmeel (bijv. uit mais) omdat dat goedkoper is dan suiker. De gisten die
de ethanol produceren kunnen echter alleen glucose of suiker als voeding gebruiken. Voorafgaand
aan de fermentatie moet het zetmeel dus worden afgebroken tot glucose. Dit gebeurt met behulp
van amylases. Amylases zijn zetmeel afbrekende enzymen die behoren tot de glycoside hydrolase
familie. Amylases waren de eerste enzymen die commercieel werden geproduceerd en verkocht.
Tegenwoordig behoren ze tot de meest belangrijke industriële enzymen en maken ongeveer 30% uit
van de totale enzym productie in de wereld. Biobrandstoffen zijn er in verschillende soorten. De
meeste biobrandstoffen zijn gemaakt van plantaardig materiaal, zoals palmolie, koolzaad, suikerriet
en maïs. Dit wordt vaak aangeduid als de ‘eerste generatie’ biobrandstof. De eerste generatie
biobrandstof wordt gewonnen uit gewassen die ook voor voedsel geschikt zijn. De tweede generatie
biobrandstoffen worden gemaakt uit afvalstoffen, zoals maïsresten of planten die niet geschikt zijn
voor voedsel, bijvoorbeeld houtsnippers. Er is ook nog een derde generatie biobrandstof in
ontwikkeling; op basis van algen en zeewier, hierbij is minder concurrentie met landgebruik. Bij de
vierde generatie produceren micro-organismen zelf de brandstof of chemicaliën. 4,5 6
Omdat er in het eerste dagdeel glucose zal ontstaan en in het tweede dagdeel gebruikt zal worden
door de gist wordt er gebruik gemaakt van een enzymatische aantoningsreactie van glucose. Alle
componenten voor de aantoningsreactie zitten in een kant en klaar reagens (Roche Glucose GOD-
PAP, R1). Glucose wordt in aanwezigheid van zuurstof uit de lucht geoxideerd door glucose oxidase
(GOD) tot gluconolactone. Het vrijgekomen waterstof peroxide (H2O2) oxideert in aanwezigheid
van peroxidase (POD), 4-aminophenazone en phenol tot 4-(pbenzoquinone-monoimino)-
phenazone. De kleurintensiteit van de rode kleurstof is recht evenredig met de glucose
concentratie en kan spectrofotometrisch worden bepaald bij een golflengte van 503 nm.
De ethanol concentratie zal worden bepaald door een interne standaard methode met behulp van
de GC, er zal door de studenten één kalibratielijn worden gemaakt waarna de rest van de monster
gemeten kunnen worden op de GC. Als interne standaard is gekozen voor 1-propanol.
, Materiaal en methode
Dagdeel 1
Eerst is 25,12 gram zetmeel (CAS Nummer: 9005-25-8) afgewogen en opgelost in zo min mogelijk
koud water, vervolgens is onder constant roeren kokend water toegevoegd tot een volume van 250
ml. De oplossing is onder roeren op een magneetroerder en een kookplaat al verwarmend aan de
kant gezet. Er is 0,05 ml van de bacteriële amylase (CAS Nummer: 9000-85-5) oplossing toegevoegd
aan 250 ml zetmeel oplossing. De reactie is in de gaten gehouden door af en toe een druppel van de
zetmeeloplossing op een petrischaal te druppelen in combinatie met een beetje jodide reagens. De
jodidestock van vorige experimenten is niet gebruikt, echter was er nog wel een andere jodide
verdunning aanwezig op het lab deze is gebruikt als jodide reagens. Na 50 minuten ontstond een
rode kleur en dit betekend dat het zetmeel is omgezet in dextrine. Vervolgens is het reactiemengsel
met 1M HCL naar pH 4,74 gebracht. Het troebele mengsel is vervolgens over een vouwfilter gegoten.
Hiervan is 5 ml aan een sample flesje toegevoegd deze is weggezet. Aan deze heldere oplossing is 0,5
ml amyloglucosidase (CAS Nummer: 9032-08-0), deze oplossing is weggezet in de koelkast om
volgende week weer mee verder te gaan. Ook is er een kalibratie reeks gemaakt van glucose, door
1,06 gram glucose op te lossen in 100 ml water. Vervolgens is een kalibratie reeks gemaakt volgens
onderstaand pipeteer schema:
Tabel 1: pipeteerschema kalibratiereeks
g/L Pippeteren uit stock Aanvullen met water Reagens (mL)
(mL) (mL)
0 0 8,5 1,5
1 1 7,5 1,5
2 2 6,5 1,5
3 3 5,5 1,5
4 4 4,5 1,5
5 5 3,5 1,5
Deze kalibratie lijn bleek niet goed gepipetteerd te zijn waardoor de waardes buiten de lijn vielen, er
is nog wel geprobeerd deze lijn te verdunnen dit had echter geen effect. De glucose stock is in de
koelkast bewaard
Dagdeel 2
Allereerst zijn de monster uit de koelkast gehaald, van het reactie mengsel is 5 mL in het sample
flesje gedaan. Het reactie mengsel werd overgegoten naar een schone erlenmeyer die vooraf
gewogen is. Hier is 10,03 gram bakkersgist aan toegevoegd, waarna dit mengsel ook werd gewogen.
De temperatuur van dit mengsel werd verwarmd naar 37°C, en de reactie werd afgesloten. Om het
kwartier is het gewicht genoteerd van het reactiemengsel.
Tussendoor is de kalibratie lijn opnieuw gemaakt door volgens onderstaand pipeteerschema te
pipetteren
Tabel 2: pipeteerschema herziende kalibratiereeks
g/L Pipeteren uit stock (mL) Aanvullen met water
0 0 10
1 1 9
2 2 8
3 3 7
4 4 6
