Samenvatting qPCR- lessen
Wat is real time PCR?
Bij een real time PCR wordt op de y-as het signaal van de fluorescentie weergeven. Met deze vorm
van PCR kan de hoeveelheid DNA bepaald worden in een monster. Maar ook hoeveel van een
bepaald gen in een bepaald monster zit, hiermee kan het verschil in gen expressie bepaald worden.
Het werkt met een fluorescentie die de hele tijd gemeten wordt. Er wordt een fluorescent label
gebruikt een veel voorkomend label is SYBR Green. Het label bindt aan het dsDNA (dubbelstrengs
DNA). In de grafiek staat een controle en een treshold waarde. Op een gegeven moment komt het
signaal boven de achtergrond uit. Op het moment dat het signaal boven de Treshold komt (Ct) wordt
het de Cq waarde genoemd. Hoe meer DNA in het monster zit, hoe sneller deze over de Treshold
komt. Hoe minder DNA hoe langzamer deze over de Treshold gaat. Het is een methode die vaak
gebruikt wordt in een biomedisch laboratorium, voor de medische research. Daarnaast wordt het
ook gebruikt voor GMO detectie bij de richting biotechnologie. Ook wordt het bij forensisch
onderzoek gebruikt, voor DNA kwantificatie.
Tevens worden corona testen uitgevoerd door middel van real time PCR. Hierbij wordt gekeken of
het monster binnen een bepaald aantal cycli boven de Cq waarde komt. Mensen die aan het einde
zitten van de corona fase kan alsnog positief getest worden, ook als deze mensen niet meer
besmettelijk zijn. Het komt dan omdat zich nog virus deeltjes bevinden in de neus, waardoor de qPCR
na een aantal cycli het DNA vermenigvuldig en boven de Cq waarde komt.
Er zijn twee verschillende types PCR:
End point PCR (conventionele PCR): hierbij wordt een PCR op een geschikt moment gestopt
(eindpuntmeting), daarna volgt nog een analyse en vervolgstappen, zoals bijvoorbeeld een
gel elektroforese. De PCR wordt na 25 tot ongeveer 45 cycli geanalyseerd. Deze methode is
niet kwantitatief. Er zijn verschillende te kortkomingen;
o Inhibitie; veel stoffen uit (klinische) monsters kunnen de PCR of andere
amplificatiereacties remmen.
o Zelf annealing
o Kwantificatie van end point is niet betrouwbaar
De analyse is na een aantal cycles compleet. Het is gebaseerd op de plateau fase, waardoor
deze minder nauwkeurig is.
, Real time PCR: bij deze PCR is het mogelijk om het hele proces te volgen door middel van
fluorescentiemetingen zonder dat hierbij vervolgstappen nodig zijn. Het wordt vaak in de
diagnostiek gebruikt. Met een programma op de computer (PC) kan het gevolgd worden met
een software programma. De DNA synthese is zichtbaar als exponentiële vermeerdering
plaatsvindt, maar ook als het eindigt met het plateau gebied.
Fluorochromen zijn moleculen die energie in de vorm van licht kunnen opnemen. Het opnemen van
licht energie door het fluorchroom = excitatie (in een aangeslagen toestand brengen). De opname
van de lichtenergie zorgt ervoor dat het fluorchroom in een hogere energietoestand terecht komt =
aangeslagen toestand. Het molecuul zal terugkeren naar de oorspronkelijke energieniveau of
terugvallen naar de grondtoestand waarbij de opgenomen energie vrij zal komen. De vrijgekomen
energie zal als licht worden afgegeven door fluorochroom, dit noemen we emissie of uitstralen. Bij
excitatie en emissie van fluorochroom gaat een gedeelte van de energie verloren gaan. De kleur
(golflengte) van het licht dat fluorochroom exciteert anders zijn dan de kleur (golflengte) van licht dat
wordt geemitteerd.
Het type fluorochroom dat gebruikt wordt, zal de kleur van de fluorescentie bepalen. Bij het
detecteren van verschillende PCR producten worden verschillende fluorochromen gebruikt (zo
ontstaan er meerdere verschillende kleuren). Het qPCR apparaat is een PCR apparaat met een
speciaal fluorescentie-excitatie (lichtbron) en fluorescentie detectiegedeelte. Het apparaat meet de
gevormde fluorescentie. Zo kan nauwkeurig bepaald worden hoeveel PCR product gevormd is,
tijdens elke PCR cycli.
Kwantificatie is als het DNA vermenigvuldigd wordt.
De hoeveelheid DNA of RNA wordt bepaald voor het inzetten van PCR. De hoeveelheid wordt
bepaald door een Optical Density (OD) door middel van een spectrofotometer. Nucleïnezuren
absorberen UV licht bij 260 nm. Eiwitten absorberen UV licht bij 280 nm (trypsine, tyrosine, phenol).
Bij 240 nm worden de contaminaties gemeten (zoals EDTA). Daar zijn een aantal standaarden bij:
A260 dsDNA = 50 ug/ml
A260 ssDNA = 40 ug/ml
A260 RNA = 40 ug/ml
De zuiverheid van het DNA wordt gemeten door een ratio van A260/A280. Bij zuiver DNA is de ratio >
1,8. Bij zuiver RNA is de ratio > 2,0.
Een voorbeeld van het bepalen van het RNA concentratie.
Het volume van het RNA = 80 ul
De verdunning die gebruikt wordt = 2 ul monster + 248 water
A260 = 0,17
Concentratie RNA in monster = 0,17*40*125 (verdunningsfactor) = 850 ug/ml = 0,85 ug/ul.
De hoeveelheid RNA in het monster (opbrengst) = 0,85 ug/ul (concentratie)* 80 ul (volume)= 68 ug.
, Met een real time kan ook naar (on)bekende mutatie gekeken worden. Deze worden dan bepaald
door de smeltcurve.
R, Rn, (delta)Rn
R = fluorescentie signaal
Rn = normalisatie reporter signaal = emissie intensiteit of reporter dye (kleurstof).
(delta)Rn = Rn – achtergrond (no template control; NTC)
ROX (carboxy-X-rhodamine) wordt gebruikt als passieve referentiekleurstof in een ROX afhankelijke
real time PCR systeem om te normaliseren voor verschillen in fluorescentieniveaus die op kunnen
treden als gevolg van optische variaties tussen de welletjes. De ROX is niet betrokken bij de PCR
reactie en ROX fluoresencentieniveaus hebben geen relatie met de hoeveelheid DNA in elk welletje,
dus de toevoeging van deze fluorofoor aan een supermix levert een constant fluorescerend signaal
op tijdens de amplificatiecycli. De constantheid van ROX fluorescentie ten opzichte van het
fluorescentiesignaal van de reporter wordt gebruikt voor well-to-well fluorescentienormalisatie.
Verschillende soorten real time PCR systemen die een passieve referentiestandaard vereisen, hebben
verschillende optimale concentraties ROX, vanwege de verschillende optische configuraties van elk
systeem, met name het type excitatiebron en de gebruikte optica.
Wat is real time PCR?
Bij een real time PCR wordt op de y-as het signaal van de fluorescentie weergeven. Met deze vorm
van PCR kan de hoeveelheid DNA bepaald worden in een monster. Maar ook hoeveel van een
bepaald gen in een bepaald monster zit, hiermee kan het verschil in gen expressie bepaald worden.
Het werkt met een fluorescentie die de hele tijd gemeten wordt. Er wordt een fluorescent label
gebruikt een veel voorkomend label is SYBR Green. Het label bindt aan het dsDNA (dubbelstrengs
DNA). In de grafiek staat een controle en een treshold waarde. Op een gegeven moment komt het
signaal boven de achtergrond uit. Op het moment dat het signaal boven de Treshold komt (Ct) wordt
het de Cq waarde genoemd. Hoe meer DNA in het monster zit, hoe sneller deze over de Treshold
komt. Hoe minder DNA hoe langzamer deze over de Treshold gaat. Het is een methode die vaak
gebruikt wordt in een biomedisch laboratorium, voor de medische research. Daarnaast wordt het
ook gebruikt voor GMO detectie bij de richting biotechnologie. Ook wordt het bij forensisch
onderzoek gebruikt, voor DNA kwantificatie.
Tevens worden corona testen uitgevoerd door middel van real time PCR. Hierbij wordt gekeken of
het monster binnen een bepaald aantal cycli boven de Cq waarde komt. Mensen die aan het einde
zitten van de corona fase kan alsnog positief getest worden, ook als deze mensen niet meer
besmettelijk zijn. Het komt dan omdat zich nog virus deeltjes bevinden in de neus, waardoor de qPCR
na een aantal cycli het DNA vermenigvuldig en boven de Cq waarde komt.
Er zijn twee verschillende types PCR:
End point PCR (conventionele PCR): hierbij wordt een PCR op een geschikt moment gestopt
(eindpuntmeting), daarna volgt nog een analyse en vervolgstappen, zoals bijvoorbeeld een
gel elektroforese. De PCR wordt na 25 tot ongeveer 45 cycli geanalyseerd. Deze methode is
niet kwantitatief. Er zijn verschillende te kortkomingen;
o Inhibitie; veel stoffen uit (klinische) monsters kunnen de PCR of andere
amplificatiereacties remmen.
o Zelf annealing
o Kwantificatie van end point is niet betrouwbaar
De analyse is na een aantal cycles compleet. Het is gebaseerd op de plateau fase, waardoor
deze minder nauwkeurig is.
, Real time PCR: bij deze PCR is het mogelijk om het hele proces te volgen door middel van
fluorescentiemetingen zonder dat hierbij vervolgstappen nodig zijn. Het wordt vaak in de
diagnostiek gebruikt. Met een programma op de computer (PC) kan het gevolgd worden met
een software programma. De DNA synthese is zichtbaar als exponentiële vermeerdering
plaatsvindt, maar ook als het eindigt met het plateau gebied.
Fluorochromen zijn moleculen die energie in de vorm van licht kunnen opnemen. Het opnemen van
licht energie door het fluorchroom = excitatie (in een aangeslagen toestand brengen). De opname
van de lichtenergie zorgt ervoor dat het fluorchroom in een hogere energietoestand terecht komt =
aangeslagen toestand. Het molecuul zal terugkeren naar de oorspronkelijke energieniveau of
terugvallen naar de grondtoestand waarbij de opgenomen energie vrij zal komen. De vrijgekomen
energie zal als licht worden afgegeven door fluorochroom, dit noemen we emissie of uitstralen. Bij
excitatie en emissie van fluorochroom gaat een gedeelte van de energie verloren gaan. De kleur
(golflengte) van het licht dat fluorochroom exciteert anders zijn dan de kleur (golflengte) van licht dat
wordt geemitteerd.
Het type fluorochroom dat gebruikt wordt, zal de kleur van de fluorescentie bepalen. Bij het
detecteren van verschillende PCR producten worden verschillende fluorochromen gebruikt (zo
ontstaan er meerdere verschillende kleuren). Het qPCR apparaat is een PCR apparaat met een
speciaal fluorescentie-excitatie (lichtbron) en fluorescentie detectiegedeelte. Het apparaat meet de
gevormde fluorescentie. Zo kan nauwkeurig bepaald worden hoeveel PCR product gevormd is,
tijdens elke PCR cycli.
Kwantificatie is als het DNA vermenigvuldigd wordt.
De hoeveelheid DNA of RNA wordt bepaald voor het inzetten van PCR. De hoeveelheid wordt
bepaald door een Optical Density (OD) door middel van een spectrofotometer. Nucleïnezuren
absorberen UV licht bij 260 nm. Eiwitten absorberen UV licht bij 280 nm (trypsine, tyrosine, phenol).
Bij 240 nm worden de contaminaties gemeten (zoals EDTA). Daar zijn een aantal standaarden bij:
A260 dsDNA = 50 ug/ml
A260 ssDNA = 40 ug/ml
A260 RNA = 40 ug/ml
De zuiverheid van het DNA wordt gemeten door een ratio van A260/A280. Bij zuiver DNA is de ratio >
1,8. Bij zuiver RNA is de ratio > 2,0.
Een voorbeeld van het bepalen van het RNA concentratie.
Het volume van het RNA = 80 ul
De verdunning die gebruikt wordt = 2 ul monster + 248 water
A260 = 0,17
Concentratie RNA in monster = 0,17*40*125 (verdunningsfactor) = 850 ug/ml = 0,85 ug/ul.
De hoeveelheid RNA in het monster (opbrengst) = 0,85 ug/ul (concentratie)* 80 ul (volume)= 68 ug.
, Met een real time kan ook naar (on)bekende mutatie gekeken worden. Deze worden dan bepaald
door de smeltcurve.
R, Rn, (delta)Rn
R = fluorescentie signaal
Rn = normalisatie reporter signaal = emissie intensiteit of reporter dye (kleurstof).
(delta)Rn = Rn – achtergrond (no template control; NTC)
ROX (carboxy-X-rhodamine) wordt gebruikt als passieve referentiekleurstof in een ROX afhankelijke
real time PCR systeem om te normaliseren voor verschillen in fluorescentieniveaus die op kunnen
treden als gevolg van optische variaties tussen de welletjes. De ROX is niet betrokken bij de PCR
reactie en ROX fluoresencentieniveaus hebben geen relatie met de hoeveelheid DNA in elk welletje,
dus de toevoeging van deze fluorofoor aan een supermix levert een constant fluorescerend signaal
op tijdens de amplificatiecycli. De constantheid van ROX fluorescentie ten opzichte van het
fluorescentiesignaal van de reporter wordt gebruikt voor well-to-well fluorescentienormalisatie.
Verschillende soorten real time PCR systemen die een passieve referentiestandaard vereisen, hebben
verschillende optimale concentraties ROX, vanwege de verschillende optische configuraties van elk
systeem, met name het type excitatiebron en de gebruikte optica.
