Praktikumstag 1: Reporter-Assay Gruppe 5
Stamm: Mut1 (△mig1) = YHUM1164 MUT1
OD600/Startwert Zeit bis OD420 ß-Gal Units
Gelbfärbung
2% Glucose 0,332 >25 bzw. keine 0,084 0,54
2% Galactose 0,226 5 min 1,792 40,5
2% Glc + 2% Ga 0,285 8 min 1,499 26,7
2% Raffinose 0,213 >25 bzw. keine 0,081 0,35
Ergebnisse wie erwartet, da das Mig1 Gen deletiert ist, findet keine Repression durch Glucose statt.
Daher finden wir neben nur Galactose, auch bei Glucose mit Galactose eine Expression des ß-
Galactosidase-Gens.
Fragen Skript:
Warum ist es unbedingt notwendig, dass die Hefezellen kein ß-Galactosidase -Gen besitzen?
Würde Hefe dieses Gen besitzen würde sich dieses Gen nicht als Reporter eignen, um die Expression
des Gal1 Gens zu messen, da wir dann Störfaktoren im Medium durch generelle Produktion von ß-
Galactosidase hätten.
Wie können sie einfach feststellen, ob Hefezellen ß-Galactosidase-Aktivität besitzen?
in unserem Fall wird hier das ONPG zu gelbem Nitro-pheno umgesetzt, was photometrisch gemessen
wird. →Millertest, Enzymaktivität, Hefen werden photometrisch gemessen
andere Möglichkeit: Zugabe von X-Gal -> Beobachtung bei LacZ Aktivität Indigoblau
Welche anderen Reporter können sie statt des ß-Gal-Gens als Reporter verwenden?
GFP (ist auch in Flüssigmedium messbar, aber nicht photometrisch nur fluorometrisch), Luciferase
Wir erwarten, dass die ß-Gal-Aktivität proportional zur Konzentration der ß-Galactosidase in den
Zellen ist. Muss das immer so sein?
In unserem Fall ist das so, aber es gibt Ausnahmen. Man kann posttranslationale Modifikation oder
Regulation haben, Endproduktrepression.
Kann ich eigentlich in der gleichen Kultur angezogene Hefezellen aufteilen und zur Hälfte für die
Analyse der ß-Gal-Aktivität und die andere Hälfte für die RT-PCR Analyse des GAL1-Gens verwenden?
Ja wurde bei uns im Praktikum genauso gehandhabt, man startet mit gleichem Produkt aus gleicher
Kultur. Selbes biologisches Replikat -> bei dem 2 biologische Nachweisreaktionen durchgeführt
werden, daher optimale Bedingungen für einen durchdachten und effizienten Versuch
Keine Abweichungen durch wechselndes Startprodukt.
Welche anderen molekularen Mechanismen können sie sich vorstellen, die zur Repression eines
Gens in Hefe führen können?
Man kann an Mig1p anderes Molekül binden oder Interaktion mit weiteren Proteinen, sodass sich
Struktur ändert und nicht mehr an DNA binden kann.
Wenn sie Proteine extrahieren würden, kann es durchaus passieren, dass die Ausbeute der
Proteinextraktionen unterschiedlich ist. Wie können sie ß-Gal-Aktivität ihrer verschiedenen Proben
trotzdem miteinander vergleichen?
, Bradford -> um Proteinmenge in allen Proben zu normalisieren.
Genotyp der Transformation
Welche Stoffe muss ich dazugeben, dass ein transformierter stamm wächst:
His, Leu, Meth, uracilfrei! -> transformierte Hefe kann auf uracilfreiem Medium wachsen
➔ Ampicilin nur um E.coli oder andere Bak nicht wachsen zu lassen
➔ Hefe nicht anfällig für Ampicilin
Fragen Kolloquium:
Die Messungen sind innerhalb des Kurses mindestens in Triplikaten durchgeführt worden.
Weicht Ihr Ergebnis von den anderen Messungen stark ab? Begründen Sie, wenn nötig, die
Abweichung.
Nein
Aus welchen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass GAL4 für die Expression von GAL1
unbedingt notwendig ist?
Aus den Werten, in dem gal4 deletiert ist findet keine Expression von Gal1 statt. (Werte überall 0)
➔ Gal4 ist essentiell für die Expression von Gal1
Warum führt die Deletion von GAL3 dazu, dass, wenn überhaupt, in allen Medien nur noch
eine minimale Expression von GAL1 nachweisbar ist?
Da GaL3 unter Galactoseeinfluss, diese bindet und dann GAL80 bindet, dadurch bindet Gal80 nicht
mehr Gal4p →Gal4p-GAL80 inhibiert GAL-Gene
Die GAL80 Deletion führt dazu, dass GAL1 im Vergleich zum WT auch in Medium mit
Raffinose exprimiert wird, obwohl Raffinose keinen Einfluss auf die Regulation des GALRegulons
hat. Wie ist das zu erklären? (Raffinose = Gluc+Fruc+Gal)
Ohne GAL80 ist die Inhibierung von Gal4p aufgehoben→Gal4p aktiviert GAL-Gene
In den ΔGAL80 Stämmen ist die Expression in den Medien Glucose bzw Glucose plus
Galactose deutlich niedriger als in Medien mit Galactose oder Raffinose. Wie ist das zu
erklären? Glucose repressiert -> Mig bindet und somit Expression aus also basal (S.6)
Die Deletion von MIG1 führt dazu, dass die Expression von GAL1 in einem Medium mit
Galactose plus Glucose in Vergleich zu einem Medium nur mit Galactose nicht mehr reprimiert
wird. Wie ist das zu erklären?
Die Repression durch Glucose wird durch das MIG1-Gen reguliert. Ist dieses Gen deletiert kann keine
Repression mehr stattfinden, da sich MIG 1 nicht in den Zellen befindet und sich somit nicht an seine
Bindungsstelle setzen kann um die Expression zu reprimieren.
Hefe hat nicht nur Mig1 Repressor, sondern auch Mig2 und Mig3 Repressor, die bei Deletion von
Mig1 teilweise die Funktion übernehmen, daher bei Gal+Glc Expression geringer als bei nur Gal.
➔ Proteinredundanz
Wie würden Sie das Reportergen-Experiment verändern, wenn Sie anstelle der GAL1-
Genexpression die GAL10-Genexpression messen wollten?
